一種納米金和λDNA鏈連接的自組裝材料的製備方法

2023-05-28 18:23:36 2

專利名稱：一種納米金和λDNA鏈連接的自組裝材料的製備方法
技術領域：
一種納米金和A DNA鏈連接的自組裝材料的製備方法，屬於材料化學技術 領域。
背景技術：
隨著納米技術向生命科學領域的不斷滲透，利用納米生物技術研究和解決 其中的重大問題，推動納米生物技術的發展，正成為當前一個重要的前沿領域 之一。膠狀的金納米粒子(AuNPs)，由於其特殊的物理、化學性質和生物相容 性，在生物電化學、材料學及生物醫學等領域有很廣泛的應用。
聚合酶鏈反應(PCR)是一種體外特定核酸序列擴增技術，是現代分子生物學 的實驗工作基礎之一，在生命科學、遺傳學和醫學等領域發揮著重要作用。PCR 通常在均一的溶液中進行，在固體界面上能否順利進行PCR是一個具有探索性 的課題。近來，Turner等人利用在微孔表面上的PCR檢測了血色素基因的突變； Adessi等人研究了玻璃表面的PCR，探討了研製DNA晶片的可能性；Lockley 等人對在尼龍表面的PCR做了初步的探索。納米粒子界面上的PCR還未見報導。 如果在納米粒子界面上能順利進行PCR，可以大大拓寬PCR技術的應用範圍， 把均相體系中的PCR技術擴展到納米粒子界面上。因此把引物連接在納米粒子 界面上，研究納米粒子界面上的PCR是有意義的。本發明系統研究了金納米粒 子界面上的PCR。為了減小引物連接在納米粒子界面上所產生的空間位阻，在 納米粒子和引物之間連接-(CH2)6-作為緩衝連接臂。通過Au-S鍵把5'端修飾 -81^-((:112)6-的引物連接在金納米粒子表面，採用質粒入DNA作為模板，用瓊脂 糖電泳和透射電子顯微鏡(TEM)等技術對PCR產物進行分析和檢測，研究了引 物濃度、退火溫度和循環次數對PCR的影響。實驗結果表明把R、 F兩種引 物連接在金納米粒子界面上，能夠順利進行PCR，且金納米粒子能被連接形成 納米粒子聚合體，由於DNA結構高溫解鏈低溫復性和鹼基互補配對的性質，使 得這種新型納米材料成為一種具有溫度可控性的自組裝材料。

發明內容
本發明的目的是提供一種納米金和X DNA鏈連接的自組裝材料的製備方 法，此種新型納米自組裝材料同時具有自組裝性和溫度可控性。
本發明的技術方案: 一種納米金和A DNA鏈連接的自組裝材料的製備方法，
步驟為(1)膠體金的製備；(2)膠體金與上下遊引物的偶聯；(3)利用所制 得的連金引物進行PCR，PCR產物進行瓊脂糖電泳和TEM電鏡掃描證明得到預 期產物；
(1) 膠體金的製備利用Frens法製備15nm左右的膠體金。 所用的玻璃儀器都強酸浸泡，雙蒸水清洗，烘箱烘千備用；製備時，向潔
淨的三角燒瓶中加入100mL質量濃度為0.01%的氯金酸和潔淨的攪拌子，中速 攪拌，加熱至沸騰，保持5 6分鐘，緊接著一次性加入質量濃度為1%的檸檬 酸三鈉溶液4mL，邊加熱邊攪拌，溶液顏色從淡黃色依次變成淺藍黑色，至深 藍黑色，最後變成酒紅色，當顏色不再變化後再繼續加熱15分鐘使反應充分完 全；最後，在攪拌的條件下，溶液冷卻至室溫，定容到100mL， 4'C保藏；
(2) 膠體金與上、下遊引物的偶聯將所製備的膠體金與引物F、 R分別 進行連接，得金納米粒子-引物複合物，即AiiNP-F及AuNP-R，處理後備用。
所用上、下遊引物(由上海生工合成)為 297bp-F: 5，-GCAGTTGCCGTTTATCTCACC畫3'， 297bp-R: 5'-GGCATAGCGTCCTCACATTTC隱3'，
將所製得的膠體金於11500 rpm離心15min，棄上清，用滅菌水恢復至原體 積的1/10，將上、下遊引物濃度稀釋至10um，以膠體金上下遊引物R或F體 積比1 : 1的比例分別混合，超聲10s左右，使之混合均勻，室溫靜置12h，向 其中加入lM的NaCl，使體系中的NaCl濃度達到0.05M，繼續室溫靜置12h， 反應完畢，先用6500rpm離心15min，棄上清，然後加含0.1 mol/LNaCl pH 7.0 的磷酸鹽緩衝溶液離心清洗，重複清洗多次除去未連接在金納米粒子界面上的 引物，最後用滅菌水定容至膠體金的體積待用，將引物連接在金納米粒子表面， 構成金納米粒子-引物複合物，即AuNP-F及AuNP-R， 4'C保藏備用；
(3) PCR:以入DNA為模板，採用製得的引物AuNP-F及AuNP-R進行 PCR。 PCR反應體系dNTPs (購自上海生工)1^L， 0.5個單位的TaqDNA聚 合酶(購自上海生工)，入DNA模板質粒(購自寶生物工程有限公司)0.5 ^L， 反應緩衝液(購自上海生工)5 ixL，取AuNP-F 3 jiL和AuNP-R 3 |uL，加滅菌 水至總體積為50 |uL;
擴增程序為94°C預變性3min; 94'C變性30s， 55'C退火30s， 72'C延伸 30 s， 40個循環；72'C再延伸3min; l(TC保存，得PCR產物；
(4) 瓊脂糖電泳取5pLPCR產物，用3%瓊脂糖凝膠電泳進行分析，採 用前染，即在溶膠前期加入溴化乙啶(EB)，濃度約為0.5|Lig/mL，電壓U=120V， 時間T:30min，進行電泳；
(5) TEM電鏡掃描 將得到的PCR產物用移液槍滴加到銅網上，置於燈下烘乾半小時，上TEM 電鏡，找到合適的結構與放大倍數並拍照。


圖l 15nm金的TEM圖。 圖2膠體金與上下遊引物的連接的電泳圖。 圖3 PCR產物的電泳圖。 圖4 PCR產物的TEM圖。
具體實施例方式
(1)膠體金的製備 所用的玻璃儀器都強酸浸泡，雙蒸水清洗，烘箱烘乾備用。製備時，向潔 淨的三角燒瓶中加入100mL質量濃度為0.01%的氯金酸和潔淨的攪拌子，中速 攪拌，加熱至沸騰，保持5 6分鐘，緊接著一次性加入質量濃度為1%的檸檬 酸三鈉溶液4mL，邊加熱邊攪拌，溶液顏色從淡黃色依次變成淺藍黑色，至深 藍黑色最後變成酒紅色，當顏色不再變化後再繼續加熱15分鐘使反應充分完全。 最後，在攪拌的條件下，溶液冷卻至室溫，定容到100mL， 4。C保藏。 (2)膠體金與上下遊引物的偶聯 所用上、下遊引物為 297bp-F: 5,-GCAGTTGCCGTTTATCTCACC畫3，， 297bp國R: 5'-GGCATAGCGTCCTCACATTTC國3'， 將所製得的膠體金11500 rpm離心15min，棄上清，滅菌水恢復至原體積的 1/10，將上下遊引物濃度稀釋至10um，以膠體金上下遊引物(R或F)體積 比l:l的比例分別混合，超聲10s左右，使之混合均勻，室溫靜置12h，向其 中加入lM的NaCl，最後體系中的NaCl濃度達到0.05M，繼續室溫靜置12h， 反應完畢，先用6500rpm離心15min，棄上清，然後加磷酸鹽緩衝溶液(含O.l mol/LNaClpH7.0)離心清洗。用上述多次清洗的方法除去未連接在金納米粒子 界面上的引物。最後用滅菌水中定容至膠體金的體積待用。將引物連接在納米 粒子表面，構成金納米粒子-引物複合物，即AuNP-F及AuNP-R， 4"C保藏備用。 (3) PCR:以ADNA為模板，採用製得的引物AuNP-F及AuNP-R進行
PCR。
PCR反應體系包括lpL dNTPs， 0.5個單位的Taq DNA聚合酶，0.5 |liL入DNA 模板質粒，5 |uL反應緩衝液，取AuNP-F 3 pL和AuNP-R 3 pL，最後加滅菌水 至總體積為50 pL。
擴增程序為94°C預變性3min; 94°C變性30 s, 55°C退火30 s， 72°C延 伸30s， 40個循環；72°C再延伸3min。 l(TC保存。
(4) 瓊脂糖電泳
取5pLPCR產物，用3%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。釆用前染，即在溶膠 前期加入EB，濃度約為0.5ug/mL,電壓U-120V，時間T=30min。進行電泳。
(5) TEM電鏡掃描 將得到的PCR產物用移液槍滴加到銅網上，置於燈下烘乾，約半小時左右，
上TEM電鏡，找到合適的結構與放大倍數並拍照。
權利要求
1.一種納米金和λDNA鏈連接的自組裝材料的製備方法，其特徵是步驟為(1)膠體金的製備；(2)膠體金與上下遊引物的偶聯；(3)利用所製得的連金引物進行PCR，PCR產物進行瓊脂糖電泳和TEM電鏡掃描證明得到預期產物；(1)膠體金的製備利用Frens法製備15nm的膠體金；所用的玻璃儀器都強酸浸泡，雙蒸水清洗，烘箱烘乾備用；製備時，向潔淨的三角燒瓶中加入100mL質量濃度為0.01％的氯金酸和潔淨的攪拌子攪拌，加熱至沸騰，保持5～6分鐘，緊接著一次性加入質量濃度為1％的檸檬酸三鈉溶液4mL，邊加熱邊攪拌，溶液顏色從淡黃色依次變成淺藍黑色，至深藍黑色，最後變成酒紅色，當顏色不再變化後再繼續加熱15分鐘使反應充分完全；最後，在攪拌的條件下，溶液冷卻至室溫，定容到100mL，4℃保藏；(2)膠體金與上、下遊引物的偶聯將所製備的膠體金與引物F、R分別進行連接，得金納米粒子-引物複合物，即AuNP-F及AuNP-R，處理後備用；所用上、下遊引物為297bp-F5』-GCAGTTGCCGTTTATCTCACC-3』，297bp-R5』-GGCATAGCGTCCTCACATTTC-3』，將所製得的膠體金於11500rpm離心15min，棄上清，用滅菌水恢復至原體積的1/10，將上、下遊引物濃度稀釋至10um，以膠體金∶上下遊引物R或F體積比1∶1的比例分別混合，超聲10s，使之混合均勻，室溫靜置12h，向其中加入1M的NaCl，使體系中的NaCl濃度達到0.05M，繼續室溫靜置12h，反應完畢，先用6500rpm離心15min，棄上清，然後加含0.1mol/L NaCl pH7.0的磷酸鹽緩衝溶液離心清洗，重複清洗多次除去未連接在金納米粒子界面上的引物，最後用滅菌水定容至膠體金的體積待用，將引物連接在金納米粒子表面，構成金納米粒子-引物複合物，即AuNP-F及AuNP-R，4℃保藏備用；(3)PCR以λDNA為模板，採用製得的引物AuNP-F及AuNP-R進行PCR；PCR反應體系dNTPs1μL，0.5個單位的Taq DNA聚合酶，λDNA模板質粒0.5μL，反應緩衝液5μL，取AuNP-F3μL和AuNP-R3μL，加滅菌水至總體積為50μL；擴增程序為94℃預變性3min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，40個循環；72℃再延伸3min；10℃保存，得PCR產物；(4)瓊脂糖電泳取5μL PCR產物，用3％瓊脂糖凝膠電泳進行分析，採用前染，即在溶膠前期加入溴化乙啶，濃度為0.5μg/mL，電壓U＝120V，時間T＝30min，進行電泳；(5)TEM電鏡掃描。
全文摘要
一種納米金和λDNA鏈連接的自組裝材料的製備方法，屬於材料化學技術領域。本發明主要內容是在金納米粒子界面上的PCR，步驟為(1)膠體金的製備；(2)膠體金與上下遊引物的偶聯；(3)利用所製得的連金引物進行PCR，產物進行瓊脂糖電泳和TEM電鏡掃描證明得到預期產物；首先製備出所需粒徑的AuNPs，與經過-SH修飾的上、下遊引物分別進行連接，構成金納米粒子-引物複合物，再以λDNA為模板，利用製得的金納米粒子-引物複合物進行PCR，得到AuNPs和λDNA鏈連接的自組裝材料。由於DNA結構高溫解鏈低溫復性和鹼基互補配對的性質，使得這種新型納米材料成為一種具有溫度可控性的自組裝材料，在諸多領域有應用潛力。
文檔編號B22F9/16GK101368198SQ20081015672
公開日2009年2月18日 申請日期2008年9月24日 優先權日2008年9月24日
發明者劉麗強, 哲 李, 杜靜潔, 胥傳來, 許定花, 愛 邊, 偉 陳 申請人:江南大學