一種適用於天然產物高通量篩選的化合物庫高效製備方法

2023-05-29 00:20:51 3

一種適用於天然產物高通量篩選的化合物庫高效製備方法
【專利摘要】本發明涉及一種複雜天然產物高通量篩選的化合物庫高效製備方法。該方法通過將常規分析型液相色譜與自動組分收集系統聯用，在軟體的控制下，運行基於優化的分析條件，設置各指紋峰的起始時間和結束時間以及收集位置，組分收集程序自動、精確收集各指紋峰，經簡單快速的脫溶劑處理即可獲得幾十個至上百個微量樣品構成的化合物庫，所製備的化合物庫可用於多種系統的高通量篩選。該組分收集系統還可以同步聯接液相色譜-質譜系統，進行收集餾分的純度檢測、結構推測和成分鑑定。本發明的化合物庫製備方法具有快速、精確、自動化程度高、操作簡便、成本較低、適用性強等優點；所製備樣品純度高，基本僅含單個化合物，極少數含有共洗脫成分。
【專利說明】ー種適用於天然產物高通量篩選的化合物庫高效製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及天然產物中化合物提取分離領域，涉及ー種適用於複雜天然產物高通量篩選的化合物庫高效製備方法。
【背景技術】
[0002]天然藥物是現代創新藥物發現的重要來源，據統計，目前上市藥物中有近50%的藥物與天然產物有關，約60%的抗癌藥和75%抗感染藥源於天然產物。近年來，國際上利用天然產物作為先導化合物，在抗菌、抗寄生蟲、防治心腦血管疾病和抗腫瘤等疾病藥物發現方面取得了重大進展，僅2005至2007年就有13個來源於天然產物及其衍生物的新藥上市。截至2008年3月，國際上處於不同臨床階段的抗癌藥中，來源於陸地植物的24個，來源於微生物的18個，來源於海洋動植物資源的9個。這些數據充分說明天然產物是現代創新藥物研發的重要寶庫。
[0003]從中草藥及其複方中發現新的先導化合物為我國的特色和公認的捷徑。但傳統的主要通過從天然藥物中分離鑑定化合物單體進行天然活性物質發現的研究模式費時、費力。提高從天然產物中發現先導化合物的效率，縮短發現時間，降低發現成本，獲得效果理想的先導化合物越來越受到重視，進行高通量活性篩選已經成為天然活性物質發現的重要手段。
[0004]高通量篩選技術是以分子和細胞水平的實驗方法為基礎，在微孔板上以自動化作業系統執行實驗過程，通過靈敏的檢測儀器採集實驗數據並對數據進行分析處理(參見:路群，顧覺奮；藥物高通量篩選技術應用研究進展，今日藥學，2010，20:2-15)。該技術充分整合了計算機控制、自動化操作、高靈敏度檢測和數據結果自動採集的優勢，適用於以靶點或細胞功能為基礎的活性成分篩選，是新藥研發技術和方法的一大進步。高通量篩選的必要條件是具備ー個大規模的化合物庫，化合物庫是創新藥物開發的源頭。目前，化合物庫的來源主要包括組合化學的自動化合成和天然藥物中分離製備兩個方面。從天然產物中分離出來的化合物，由於其母核結構和活性基團由長期的自然選擇形成，它們所表現出來的廣泛的生物活性在藥物發現中具有人工合成化合物所無法比擬的優勢；此外，自然界的植物、動物及微生物數量眾多，且包含化合物的結構類型多祥，僅一味中藥就含有幾十個甚至上百個成分。所以，天然產物來源的化合物在質量上和數量上都為高通量篩選的理想選擇，天然來源的化合物庫建設已經或正在成為跨國製藥企業及藥物研發部門致力於開展的重要內容。
[0005]目前，對源於天然產物的化合物庫主要通過從自然界的植物、動物、微生物和海洋生物中經多次分離純化來製備單體化合物，這是目前建立天然產物庫的主要途徑。因天然藥物成分複雜，含量高低差異懸殊，ー些難分離成分和微量成分不容易分離得到，且ー些不穩定成分在分離過程中易丟失。因此，這種方式投入人力物カ大，分離周期長，難以形成規模化製備。這也是目前已建成天然產物庫的化合物數量，遠遠低於自然界中實際存在的天然化合物數量的主要限制性原因。另有報導將天然產物提取物採用製備型高效液相分離，按時間分為若干段收集。一般情況下，每隔3min或5min收集ー個餾分，近年來，也有文獻報導更精細地姆隔Imin收集單個懼分(參見:Tyler A.Johnson, Johann Sohn, WayneD.1nman, et al.Natural Product Libraries to Accelerate the High-ThroughputDiscovery of Therapeutic Leads.Journal of Natural Products.2011, 74:2545-2555.Tim S.Bugni, Mary Kay Harper, Malcolm ff.B.McCulloch, Jason Reppart and ChrisM.1reland.Fractionated Marine Invertebrate Extract Libraries for DrugDiscovery.Molecules.2008, 13, 1372-1383)。採用製備型液相分離，假設採用直徑20mm,長250mm色譜柱,色譜分離時間為60min,流速以20ml/min計算,姆_ Imin收集ー個樣品，可收集60個餾分，每個餾分體積為20ml。由於天然藥物成分複雜，流動相中大多含水，通常至少需花費48h或更長時間才能去除各餾分的溶劑，得到乾燥粉末用於活性測定和液質分析。因天然藥物中含有眾多成分且結構複雜多祥，按時間分段收集的餾分往往一個餾分中就包含3個以上甚至更多化合物，經初次活性測定後，還需要對顯示有活性的餾分進一歩分離純化製備出單體化合物，即需再次重複進行樣品富集、分離純化、餾分收集、溶劑去除、樣品乾燥、活性測試和結構鑑定等繁瑣的操作步驟，來確定活性餾分中的活性成分。這樣重複進樣收集，整個製備周期需要花費幾個月甚至更長的時間，大大降低了高通量篩選的效率。
[0006]CN1287109A公開了ー種用於製備大量相關化合物組合庫的HPLC方法,但是該方法所製備的化合物必須具有類似的洗脫條件，而且採用HPLC分離後的組分純度不夠高，還需要TLC等方法進ー步輔助分離。CN1044339A公開了ー種具有多個自動收集裝置的液相色譜系統，該系統具有使混合物樣品中的大量組分可被分別收集的優點，以及可使任意被收集的組分有選擇地和自動地進行重新分離的優點，但是該系統所得到的組分純度也不夠聞。
[0007]CN101294975A公開了ー種成組毒理學分析儀，該裝置由組分分離模塊、組分收集模塊、自動機械臂、溶液處理平臺、化合物測定模塊、數據處理與控制系統六大模塊組成，能夠在線高通量完成樣品分離、組分分析與生物活性分析等三部分相對繁雜的工作，其所分離的組分仍以混合物為主。
[0008]現有技術中對天然產物高通量化合物庫的製備方法做了眾多的嘗試，張曉哲(基於構庫思想的中藥分離與表徵方法研究，中國科學院研究生院(大連化學物理研究所)博士論文，2004年，113-129)提出樣品先進行粗分離，然後先用分析型高效液相色譜優化條件，然後再用製備型高效液相色譜線性放大，來進行天然產物高通量化合物庫的HPLC製備。褚洪標；等(天然產物樣品的高通量製備技木，《雲南化工》，第30卷第3期，2003年12月31日，58-60頁)和黃麟；等(高通量分離純化技術在天然產物化學中的應用，《國外醫學藥學分冊》，第30卷第3期，2006年12月31日，354-357)都提出採用在HPLC色譜後聯用固相萃取技術(SPE)，來解決經典的色譜不能完全分離天然產物複雜多樣的樣品的問題。此外，現有技術中還有人採用在製備高效液相後，連接多個色譜柱進行進一歩的分離提取的方法來製備天然產物化合物庫。
[0009]綜上所述，現有技術中雖然已經有了採用HPLC來進行天然產物高通量化合物庫製備的嘗試，但是主要採用製備型HPLC，並且還要結合其他後繼的分離純化技術手段，或者再次進行多通道的製備純化，方法仍然較繁瑣，不能通過一次HPLC分離即得到以單體化合物為主的化合物庫，並不能直接用於高通量篩選，因此，這些方法仍需要進ー步的改進。

【發明內容】

[0010] 本發明建立了一種適用於天然產物高通量篩選的化合物庫高效製備方法。
[0011]本發明的具體エ藝如下:
[0012]ー種適用於天然產物高通量篩選的化合物庫高效製備方法，該方法包括下述步驟:
[0013] a)選取ー種天然產物作為分析對象；
[0014] b)採用常規分析型液相色譜系統與自動組分收集系統聯用，建立上述分析對象的全成分色譜指紋圖譜分析方法；
[0015]c)運行步驟b)中的色譜指紋圖譜分析條件，通過軟體設置各指紋峰的起始時間和結束時間以及收集位置，編輯組分收集系統的程序，自動、精確收集各指紋峰；
[0016]d)針對每個指紋峰，分別運行f 2次餾分收集程序；
[0017]e)將每個餾分經簡單的脫溶劑處理獲得微量樣品；
[0018]f)從分析對象製備所得的所有微量樣品即構成了一個供高通量篩選的化合物庫。
[0019] 本發明的製備方法，步驟a)中的天然產物是天然來源的植物、動物、微生物、海洋生物、中藥複方的提取物或由其活性導向分離得到的提取物部位。所述的提取物選自是採用高、中、低極性或不同酸鹼性溶劑分別提取天然產物或所得到的提取物。優選地，高、中、低極性溶劑是選自水、醇、醚、酮、二醇衍生物、酷、芳香烴類、滷代烴類、脂肪烴類、吡啶、苯酚、こ腈中的ー種或幾種，酸鹼性溶劑是選自有機酸、無機酸、無機鹼、氨水中的一種或幾種。更優選地，高、中、低極性溶劑是選自水、こ醇、甲醇、正丁醇、氯仿、こ醚、丙酮、こ酸こ酷、苯、正己烷、石油醚中的ー種或幾種，酸鹼性溶劑是選自鹽酸、硫酸、磷酸、檸檬酸、こ酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水中的ー種或幾種。
[0020]本發明的製備方法，步驟b)中的液相色譜系統的色譜條件可以是:色譜條件可以是:分離採用的色譜柱內徑≥10mm、粒徑；5 u m ;流速為0.5-5mL/min,分析時間≥3h ;優選的，色譜條件可以是:分離採用的色譜柱內徑10mm、粒徑; 5 u m ;流速為l~2mL/min,分析時間≥2h ;更優選的，色譜條件可以是:分離採用的色譜柱內徑≥5mm、粒徑≥5pm ;流速為1~2mL/min,分析時間< 2h。
[0021]本發明的製備方法，步驟b)中的自動組分收集器包括自動進樣系統、自動餾分收集系統和LEAP Shell-PAL軟體作業系統三個部分。
[0022]本發明的製備方法，步驟b)中的色譜指紋圖譜重現性良好，各色譜峰的保留時間前後一致,其中大部分色譜峰的分離度大於1.5。
[0023]本發明的製備方法，步驟c)中的軟體用來聯結並控制常規分析型液相色譜系統和自動組分收集系統，使得兩個系統之間信號傳遞與進樣器同歩，並控制組分收集器，實現按單個色譜峰分別進行收集；該系統中所使用的檢測器為紫外檢測器、示差折光檢測器或分流串接的蒸發光散射檢測器、質譜檢測器。
[0024]本發明的製備方法，步驟c)中是根據確定的色譜條件在液相工作站輸入流動相洗脫程序；然後，根據確定的指紋圖譜中各指紋峰的保留時間，在組分收集控制系統編輯各指紋峰的收集程序。即按出峰順序給每個色譜峰編號，輸入每個色譜峰的收集時間和收集位置，「 start」為色譜峰起始時間，「stop」為色譜峰結束時間，「location」為餾分收集的相應位置，可根據餾分的體積適當調整收集容器的大小。考慮到液相色譜檢測系統和餾分收集系統之間連接管線引起的時間延遲，可根據管線長度、管線直徑和溶液流速計算延遲時間，井根據實際譜圖對各個色譜峰的收集時間進行相應調整，提高餾分收集的精確性。設置好液相洗脫程序和餾分收集時間程序後，保存各自方法至特定路徑，下次製備相同的樣品時只需要運行相同方法即可。
[0025]本發明的製備方法，步驟c)中的軟體設置是以指紋圖譜的每個指紋峰的實際出峰時間為依據，單個色譜峰的收集是通過編輯餾分收集端的該指紋峰的起始時間和結束時間。
[0026]本發明的製備方法，步驟d)中的每次採用常規分析型高效液相色譜系統進樣r2oui提取液，運行次數視所接收餾分的濃度和含量高低而定。
[0027]本發明的製備方法，將步驟e)中收集得到的餾分(I次進樣製備的每個餾分體積^ 2ml)採用氮吹、加熱或真空離心乾燥等方式進行快速脫溶劑處理；步驟e)中的每個餾分的純度高，以含有單個化合物為主，極少數含有共洗脫成分，大多數色譜峰純度高於95% ；能用於設計高、中、低三個給藥濃度進行給藥，大大減少了假陽性的結果。
[0028]本發明的製備方法，步驟f)的供高通量篩選的化合物庫適用於細胞、細胞器、蛋白質水平的快速活性篩選；其中化合物庫含有幾十個至上百個微量樣品。
[0029]本發明的製備方法中，該常規分析型液相色譜-組分收集系統同步聯接質譜檢測器，同時將液相流出液在線按比例分流進入質譜檢測器，對收集得到的各餾分進行純度檢測、結構推測和成分鑑定。
`[0030]其中， 申請人:以該方法進行了丹參高通量篩選的化合物庫的製備，其具體製備方法包括如下步驟:
[0031](I)粉碎丹參，用こ酸こ酯提取丹參，提取液低溫冷凍乾燥，製得丹參こ酸こ酯提取物；
[0032](2)採用常規分析型液相色譜系統與自動組分收集系統聯用，建立丹參こ酸こ酯提取物的全成分色譜指紋圖譜分析方法；
[0033]高效液相色譜條件:
[0034]半製備型色譜柱:AgilentZorBax SB-C18 column (9.4mm X 250mm, 5 u m)流速:2ml/min,進樣量為20iil;或分析型色譜柱:Agilent ZorBaxSB_C18column (4.6mmX 250mm, 5 u m),流速:0.5ml/min,進樣量為 2 U I ；
[0035]柱溫:30°C ;流動相:A相為0.1%甲酸水，B相為こ腈；梯度洗脫程序=O-1Omin,7-17%B ；10-12min, 17-20%B ;12_14min，20%B ;14_18min，20-21%B ; 18_34min，21%B ；34-40min,21-29%B ;40_57min，29_35%B ;57_67min,35_65%B ;67_87min，65_70%B ；87-93min,70-80%B ;93_102min，80_90%B ; 102-1 IOmin, 90_100%B ;檢測波長 28Inm ；
[0036](3)運行步驟(2)中的色譜指紋圖譜分析條件，進樣系統和收集系統均由軟體控制，通過軟體設置各指紋峰的起始時間和結束時間以及收集位置，編輯組分收集系統的程序，自動、精確收集各指紋峰；
[0037](4)用容器共收集到75個不同色譜峰餾分，針對每個指紋峰，分別運行f 2次餾分收集程序；[0038](5)所有餾分將由程序按編號收集於特定的位置中，使收集完畢後用真空離心乾燥濃縮裝置進行低溫離心乾燥處理，離心時間為3h ；
[0039](6)丹參乙酸乙酯提取物所得的75個微量樣品乾燥後構成了一個供高通量篩選的化合物庫。該化合物庫能用於不同系統的活性測試，例如:細胞、細胞器、蛋白質水平的快速活性篩選。
[0040]相比於傳統製備方法，本發明具有以下優點:
[0041]1、本發明的製備方法快速、簡便。
[0042]本方法通過採用常規分析型液相色譜系統進行1~ 2次進樣收集(每次分析通常可在2h內完成)，即可獲得高通量篩選所需的樣品量，不同於已往採用製備型高效液相系統分離製備天然藥物餾分的方法，不需要進行反覆多次的樣品累積製備，縮短了構建化合物庫的時間。本方法克服了不能使用分析型液相色譜系統進行高通量化合物庫製備的技術偏見。
[0043]2、本發明的製備方法精密度、重複性良好。
[0044]對於成分複雜的天然來源樣品，基於常規分析型高效液相色譜的分離度和精細程度，明顯優於製備型高效液相色譜。並且經過方法學考察，即通過測定日內精密度、日間精密度和不同批次提取樣品的重複性，也證明該方法精密度、重複性良好。
[0045]3、本發明的製備方法對所要組分收集更有針對性和普適性。
[0046]本方法通過相關軟體能編輯每個色譜峰的起止時間，因此即使對微量成分、指定成分和未達到基線分離成分也能很好的收集。而現有技術中按設定閾值收集色譜峰的方法，因其無法收集低於閾值的部分，最大缺陷就是對微量成分的收集不完全，不適用於複雜體系中成分含量差異懸殊的樣品製備。
[0047]4、本發明的製備方法無須經方法轉化，即可與其他分析檢測系統同步聯結，直接對每個餾分的純度檢測、質譜鑑定等操作。
[0048]本方法建立的常規分析型液相色譜-組分收集系統，可通過在線分流到質譜檢測器，同步聯接液相色譜-質譜系統，進行天然化合物庫的成分快速檢出和成分分析，並可通過相關信息指導進一步的活性導向分離純化，製備活性單體。
[0049]5、本發明的製備方法的產物純度高、純化容易。
[0050]該方法通過建立常規分析型液相色譜-自動組分收集系統，通過軟體設置各指紋峰的起始時間和結束時間，編輯程序自動、精確收集各指紋峰，運行1~2次餾分收集程序，再進行簡單的脫溶劑即可得到產物，每個餾分的純度較高；經液質聯用分析鑑定，該方法收集的餾分中大多只含有單個化合物，大多數色譜峰純度高於95%，其純度遠遠高於現今按時間段收集餾分的方法，與已有的按設定閾值收集色譜峰的樣品製備方法也有所不同。
[0051]6、本發明的製備方法的產物可以實現量效關係的考察，篩選準確度和可靠性更聞。
[0052]基於該方法製備的高純度餾分，按不同比例稀釋，製備得到高、中、低不同濃度樣品，可進行高通量活性測試和量效關係的考察，進一步排除假陽性的篩選結果，提高篩選準確度和可靠性，這是目前通過製備型HPLC收集以混合物為主的餾分，以單個濃度給藥測定所無法實現的。【專利附圖】

【附圖說明】
[0053]圖1是四種不同類型色譜柱分離丹參提取物在281nm下檢測的色譜圖比較，其中圖1中的圖譜的HPLC條件如下:
[0054]A:AgilentllOO 製備液相，Shim-pack PREP-ODS (20.0mmIDX250mm,填料粒徑:15 μ m),進樣量:120 μ 1，流速:9.5ml/min ;
[0055]B:AgilentllOO 製備液相，YMC-Pack ODS-C18 (20.0mm IDX250mm,填料粒徑:5 μ m),進樣量:100 μ 1，流速:9.0ml/min ;
[0056]C:AgilentllOO 分析液相，半製備型色譜柱:Agilent ZorBaxSB_C18column (9.4mmX 250mm,填料粒徑:5 μ m),進樣量:20 μ I,流速:2.0ml/min ；
[0057]D:Agilentl 100 分析液相，分析型色譜柱:Agilent ZorBaxSB_C18column (4.6mmX 250mm,填料粒徑:5 μ m),進樣量:2 μ I,流速:0.5ml/min。
[0058]圖2為常規分析型液相色譜-組分收集系統對丹參提取物按單個色譜峰收集餾分的方法製備得到的樣品純度，圖2和圖3中兩種不同製備方法均選取不同時間點分布的7個色譜峰餾分，在經過相同的樣品濃縮處理之後進樣分析，兩者所用的分析條件一致。
[0059]圖3為製備液相色譜-組分收集系統對丹參提取物按時間段收集餾分(0.5min/fraction)的方法製備得到的樣品純度，圖2和圖3中兩種不同製備方法均選取不同時間點分布的7個色譜峰餾分，在經過相同的樣品濃縮處理之後進樣分析，兩者所用的分析條件—致。
[0060]圖4是常規分析型液相色譜-組分收集系統對丹參提取物進行多次餾分收集的色譜圖和相似度分析。
[0061]圖5是收集丹參提取物中得到的不同餾分基於Nrf2_ARE通路的報告基因活性檢測數據。
【具體實施方式】
[0062]下述實施例是採用本發明製備方法製備複雜天然產物化合物庫並進行高通量篩選的示例，本文所述的實施方案僅是示例性的而不是意圖限制本發明的範圍。因此，應當清楚地理解，本領域技術人員應當理解本發明的技術方案可以進行許多和各種變化而不偏離本發明的精神，例如，可以用於其他各種類型的天然產物的化合物庫的建立並進行相應化合物庫中的藥理活性成分的高通量篩選。
[0063]實施例1:丹參提取物中激活Nrf2_ARE通路的活性成分快速篩選
[0064]1.實驗材料和試劑
[0065]丹參藥材:陝西商洛；試劑:色譜純乙腈(Merck，德國)，色譜純甲酸(96% ；Fairfield,美國),超純水(Millipore,美國),分析純甲醇(漢邦科技公司，中國南京)，分析純乙酸乙酯(漢邦科技公司，中國南京)。
[0066]2.實驗儀器
[0067]美國AgilentllOO高效液相色譜儀，配有自動進樣器、二元泵和紫外檢測器；CTC組分收集器，美國CTC通用集團(上海)；低溫冷凍離心乾燥機(賽默飛世爾科技公司ThermoFisher Scientific);旋轉薄膜蒸發儀(Biichi,瑞 士)；LABC0NC0 冷凍乾燥儀；SovallEvolution RC型高速冷凍離心機(KENDR0，美國)；數顯恆溫水浴鍋(HH_2) ；BP211D十萬分之一電子天平(Sartorius);真空離心乾燥濃縮裝置(Thermo savant SPD2010)。
[0068]3.實驗方法
[0069]3.1提取物製備
[0070]稱取250g丹參粉末，放入圓底燒瓶，加2000ml乙酸乙酯於水浴鍋中加熱回流提取兩次，每次30min。合併兩次濾液，50°C下旋轉蒸發濃縮，再經冷凍乾燥，製備得到提取物凍乾粉，保存於密閉的乾燥器中。每次使用時取適當樣品用純甲醇溶解，離心後取上清液，即得分析樣品。
[0071]3.2色譜分析條件
[0072]HPLC-UV條件:製備型色譜柱 1:Shim_pack PREP-0DSC20.0mm IDX 250mm, 15 μ m)；製備型色譜柱2 =YMC-Pack ODS-C18 (20.0mm ID X 250mm, 5 μ m);半製備型色譜柱:Agilent ZorBax SB_C18column (9.4mmX 250mm, 5 μ m);分析型色譜柱:Agilent ZorBaxSB-C18column (4.6mmX 250mm, 5 μ m)。柱溫:30°C;流動相:A 相為 0.1% 甲酸水,B 相為乙腈；梯度洗脫程序:0-10min,7-17%B ；10-12min, 17_20%B ; 12_14min，20%B ; 14_18min，20_21%B ；18-34min，21%B ;34_40min，21_29%B ;40_57min，29_35%B ;57_67min，35 - 65%B ;67_87min，65-70%B ;87-93min，70 - 80%B ;93_102min，80_90%B ; 102-1 lOmin，90_100%B。流速依次分別為:9.5ml/min、9.0ml/min、2ml/min 和 0.5ml/min 和進樣量依次分別為 120 μ 1、100 μ 1、20 μ I和2μ 1，檢測波長281nm。
[0073]3.3質譜條件
[0074]T0F/MS條件:電噴霧離子源參數:乾燥氣流速(N2Drying gas f low-rate): 10.0L/min ;乾燥氣溫度(Drying gas temperature):330°C ;霧化氣壓力(Nebulizer):241kPa(35psig);毛細管電壓(Capillary voltage):3000V ;裂解電壓(Fragmentor):120?420V ；skimmer voltage, 60V ；octapole DC I, 37V ；octapole radio frequency, 250V。 數據米集和分析分別由 Agilent MassHunter Acquisition 軟體(Agilent,美國)和 AppliedBiosystems/MDS-Sciex Analyst QS 軟體(Frankfurt,德國)完成。
[0075]3.4餾分收集及脫溶劑處理
[0076]自動組分收集器包括自動進樣系統、自動餾分收集系統和LEAPShell-PAL軟體作業系統三個部分，進樣系統和收集系統均由軟體控制。實驗中編輯色譜峰的前後出峰時間，所有餾分將按編號收集於特定的位置中，收集的容器包括試管和96孔板，其中試管的型號有:2ml、8ml和20ml,96孔板可以是深孔板和微孔板等。本實驗使用8ml的試管共收集75個不同色譜峰餾分，收集完畢後用真空離心乾燥濃縮裝置進行低溫離心乾燥處理，離心時間為3h。乾燥後的樣品即可用於不同系統的活性測試。
[0077]3.5Nrf2報告基因檢測
[0078]將抗氧化反應元件插入螢火蟲螢光素酶載體pGL4.26，構建重組質粒pGL4_ARE，與海腎螢光素酶載體PRL-TK共同轉染293T細胞。待96孔板中細胞密度達到70%_90%時進行瞬時轉染，轉染方法如下(詳見Lipofectamin2000轉染試劑說明書)。對於每孔細胞，使用25 μ I opt1-MEM培養基稀釋0.2 μ gDNA,多孔操作可以批量製備，室溫放置5min。使用 25μ1 opt1-MEM 培養基稀釋 0.5μ I Lipofectamine2000 試劑，室溫靜置 5min。以1:1的比例混合稀釋的DNA和稀釋的Lipofectamine2000，室溫靜置20min。直接將兩者的複合物緩慢滴加到每孔的細胞中，在37°C，5%C02孵箱中培養24h。293T細胞轉染24h後，吸棄細胞上清液，將配製好的不同濃度的受試藥物以100 μ I/孔緩慢加入孔內，每組3孔重複。培養24h後，收取細胞樣品，對其進行報告基因檢測，即用酶標儀測定螢光素酶活性和β -半乳糖苷酶活性。數據處理:螢光強度值/β-gal吸收值(減去空白)，得到相對螢光素酶活性，即相對發光值(Relative Light Unit, RLU)。用各個給藥的相對發光值除以對照組的相對發光值，得到各個組的螢光誘導表達倍數。
[0079]4.實驗結果
[0080]4.1丹參藥材提取物的色譜表徵
[0081]因天然藥物所含成分較多，化合物性質差別較大，要對全成分進行分離，通常採用250mm長的常規分析型色譜柱進行分析，且需要採用梯度程序洗脫和花費一定的分離時間才能得到比較滿意的指紋圖譜。實驗分別比較了四種不同規格色譜柱(見3.2分析條件部分)的分離效果及不同色譜參數。通常使用的製備型色譜柱填料粒徑一般大於分析型色譜柱填料粒徑，在一定程度上會降低分離度，如圖1A所示，對於成分極為複雜的天然藥物提取物，使用製備液相常用的製備型色譜柱(20.0X250mm，粒徑15 μ m)獲得的分離效果(圖1A)遠不如採用5μπι粒徑填料色譜柱(包括製備型、半製備型和分析型)的分離效果(圖1Β、圖1C和圖1D)，但是考慮到用5μπι粒徑的填料來裝填製備型的色譜柱，其成本較高，使用壽命較短，並非經濟實用型，且使用過程中因流速較大，流動相浪費，微量樣品損失比較嚴重。而在圖1C和圖1D中，兩根色譜柱分離效果無明顯差別，但採用直徑9.4_的半製備型色譜柱比直徑4.6mm的分析型色譜柱，上樣量可提高10倍以上，一次性收集得到的餾分樣品足以用於細胞或蛋白水平的活性篩選，故建議使用相同粒徑填料的半製備型色譜柱。為更客觀地比較本發明方法與常規按時間段收集組分方法在複雜樣品收集製備方面的優勢，我們用兩種不同製備方法(相同色譜柱)以選取不同時間點分布的7個色譜峰餾分在經過相同的樣品濃縮處理之後進樣純度驗證，比較常規分析型液相色譜-組分收集系統按單個色譜峰收集餾分方法(圖2)和製備液相色譜-組分收集系統按時間段收集餾分(0.5min/fraction)(圖3)的純度驗證結果。從圖2和圖3中可以發現,基於單個色譜峰收集的懼分都只含有單個化合物，而用常規按時間段收集的方法，雖然收集時間只設定在每個餾分
0.5min，但每個餾分中還是含有多個成分，尤其不利於微量成分的分離和製備，收集得到的餾分純度較低。可見，本發明方法的餾分收集純度遠遠超過常規的餾分收集方法。此外，常規製備型液相組分收集方法因使用較高的流速，得到的餾分溶劑量大，溶劑揮發費時耗力。而在分析型液相色譜系統上，採用直徑< IOmm的色譜柱(粒徑5 μ m)，可對複雜組分獲得較為理想的分離效果，且得到的餾分溶劑量相對較小，溶劑揮發或去除較容易。丹參中的主要化學成分包括水溶性成分和脂溶性成分，通過改變流動相洗脫梯度，圖1C中的各色譜峰基本達到基線分離，為下一步指紋峰收集時間的確定提供了依據。
[0082]4.2餾分的收集及質譜驗證
[0083]餾分收集軟體是基於LEAP Shell-PAL軟體改進而來，編輯每個色譜峰的名稱(Sample ID)、收集時間(Start和Stop)、收集位置(Sample Vial),列入方法表中並保存。根據圖1的色譜圖共收集75個餾分，餾分收集時間最短的為0.6min，時間最長的為2min。收集的餾分需進行色譜和質譜驗證，實驗中挑選7個不同時間的餾分，洗脫程序與指紋圖譜的洗脫梯度一致。色譜驗證結果見圖2和圖3，收集到的餾分基本上僅為單個色譜峰。再經飛行時間質譜(TOF)驗證，通過精確分子量和色譜峰的保留時間可以確定大部分餾分均為純度較高的單一成分。
[0084]4.3方法的重現性考察
[0085]為了考察該製備方法的穩定性，通過重複進樣實驗進行了餾分收集的重現性考察，利用相似度軟體評價了指紋色譜的相似度(圖4)。如圖所示，相似度值均在95%以上，保留時間偏移為正負0.05s(tK±0.05s)，可以滿足不同階段活性篩選樣品製備和質譜鑑定的需要。
[0086]4.4基於報告基因方法的活性成分篩選
[0087]構建以Nrf2為分子靶標報告基因系統，通過檢測螢光素酶活力來評價化合物激活Nrf2-ARE通路的活性。將收集到的餾分溶解在200ul含1%DMS0的無血清培養基中，稀釋成高、中、低三個濃度後，加入到轉染好質粒的293T細胞中，經藥物孵育20h後，提取蛋白測定其吸光值，並計算得到相對螢光素酶活力，螢光倍數值超過對照組兩倍以上的化合物為活性成分。通過初步篩選(見圖5)，從丹參提取物的75個餾分中共篩選出20個餾分，經LC-MS鑑定為20個活性成分，其中，除丹參酮IIA有相關活性報導外，另外19個化合物均沒有該通路活性的報導，各餾分活性測試結果列於表1，其作用機制有待進一步研究。
[0088]表1相對螢光素酶活力> 2.5的活性餾分測試結果
[0089]
【權利要求】
1.ー種適用於天然產物高通量篩選的化合物庫高效製備方法，其特徵在於，包括下述步驟: a)選取ー種天然產物作為分析對象； b)採用常規分析型液相色譜系統與自動組分收集系統聯用，建立上述分析對象的全成分色譜指紋圖譜分析條件； c)運行步驟b)中的色譜指紋圖譜分析條件，通過軟體設置各指紋峰的起始時間和結束時間以及收集位置，使組分收集系統的程序根據上述設置，自動、精確地收集各指紋峰； d)針對每個指紋峰，分別運行f2次餾分收集程序； e)將每個餾分經簡單的脫溶劑處理獲得微量樣品；以及 f)從分析對象製備所得的所有微量樣品即構成了一個供高通量篩選的化合物庫。
2.如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，步驟a)中的天然產物是天然來源的植物、動物、微生物、海洋生物、中藥複方的提取物或由其活性導向分離得到的提取物部位。
3.如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，步驟b)中的常規分析型液相色譜系統的色譜條件如下:分離採用的色譜柱內徑≤10mm、粒徑;^ 5 u m ;流速為0.5-5mL/min,分析時間≤3h。
4.如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，步驟b)中的色譜指紋圖譜重現性好，各色譜峰的保留時間前後一致，其中大部分色譜峰的分離度大於1.5。
5.如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，步驟c)中的軟體用來聯結並控制常規分析型液相色譜系統和自動組分收集系統，使得兩個系統之間信號傳遞與進樣器同歩，並控制組分收集器，實現按單個色譜峰分別進行收集；該步驟中所使用的檢測器為紫外檢測器、示差折光檢測器或分流串接的蒸發光散射檢測器、質譜檢測器。
6.如權利要求5所述的製備方法，其特徵在於，步驟c)中的軟體設置是以指紋圖譜的每個指紋峰的實際出峰時間為依據，單個色譜峰的收集是通過編輯餾分收集端的該指紋峰的起始時間和結束時間實現的。
7.如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，步驟e)中的每個餾分的純度高，以含有單個化合物為主，大多數色譜峰純度高於95%。
8.如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，步驟f)的供高通量篩選的化合物庫適用於細胞、細胞器、蛋白質水平的快速活性篩選；其中化合物庫含有幾十個至上百個微量樣品。
【文檔編號】G01N30/06GK103487531SQ201310032626
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年1月28日 優先權日:2013年1月28日
【發明者】李萍, 陳君, 張慧, 羅麗平, 宋慧鵬, 周萍 申請人:中國藥科大學