基於木聚糖酶的工程菌及其實現方法

2023-06-28 16:31:16 2

基於木聚糖酶的工程菌及其實現方法
【專利摘要】一種生物工程【技術領域】的基於β-葡萄糖苷酶的工程菌及其實現方法，該木聚糖酶基因克隆自灰色鏈黴菌(Streptomyces?griseorubens)JSD-1，將其連接到表達載體上得到重組表達載體，進一步將該重組表達載體導入大腸桿菌並誘導合成木聚糖酶。本發明克服現有技術中的內切-β-1,4-木聚糖酶多為胞內酶且表達量較低，應用範圍受限等不足，應用基因工程菌表達本發明所述的內切-β-1,4-木聚糖酶基因製備木聚糖酶，可為木聚糖酶的規模化發酵生產提供一種新方法。
【專利說明】基於木聚糖酶的工程菌及其實現方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及的是一種生物基因工程【技術領域】的基因及其實現方法，具體是一種能夠外源表達定向進化內切-β-1，4-木聚糖酶(Sg-Xya)的大腸桿菌工程菌及其實現方法。
【背景技術】
[0002]木質纖維素是植物界中最為豐富的天然高分子化合物，是植物通過光合作用產生的主要乾物質，主要包括纖維素、半纖維素和木質素。據估計，每年全世界綠色植物光合作用產生的木質纖維素總乾重為1730億t，所含總能量可達2 X 1018kJ，相當於每年全世界消耗能量的10倍。木質纖維素的生物降解和解聚作用是一個高度複雜的過程，它涉及眾多酶系的參與。
[0003]木質纖維素中的半纖維素組分是由幾種不同類型的單糖構成的異質多聚體，這些糖是五碳糖和六碳糖，包括木糖、阿伯糖、甘露糖和半乳糖等。半纖維素主要分為三類:聚木糖類、聚葡萄甘露糖類和聚半乳糖葡萄甘露糖類，其中聚木糖類是以l，4-13_D-吡喃型木糖構成主鏈，以4-氧甲基-吡喃型葡萄糖醛酸為支鏈的多糖；聚葡萄甘露糖類是由D-吡喃型葡萄糖基和吡喃型甘露糖基以1，4-β型連接成主鏈；另一類聚半乳糖葡萄甘露糖類則還有D-吡喃型半乳 糖基用支鏈的形式以1，6-α型連接到此主鏈上的若干D-吡喃型甘露糖基和D-吡喃型葡萄糖基上。半纖維素在木質組織中佔總量的50%，它結合在纖維素微纖維的表面，並且相互連接，這些纖維構成了堅硬的細胞相互連接的網絡。
[0004]半纖維素的主要降解酶有內切-β -1, 4-木聚糖酶(Endo-β -1, 4-xylanases)和β -1, 4-木糖苷酶(β -1, 4-xylosidase)，此外，半纖維素的降解還需要木聚糖酯酶、α -葡糖醒酸酶(a -glucuronidases)、a -L-阿拉伯呋喃糖酶(a -L-arabinofuranosidase)和乙醯酯酶(Acetylesterase)等輔助酶的作用。由此可見，內切_β _1，4_木聚糖酶在纖維素的酶降解過程中起十分關鍵的作用。
[0005]目前，大量的內切_β- 1，4 -木聚糖酶基因均已被成功克隆和表達。與真核生物基因相比，原核生物基因結構簡單、無內含子，具有易克隆、易表達及種類多等優勢。灰略紅鏈黴菌(Streptomyces griseorubens)是一種常見的土壤細菌(或放線菌)。灰略紅鏈黴菌之前的研究重點為如何改造其代謝途徑以提高抗生素尤其是鏈黴素的發酵產量，對其基因組內其他功能基因的開發和利用還相對較少。
[0006]與大多數細菌相比，鏈黴菌具有較為複雜的生長、分化機制，基因組較其他的原核生物也更大，可達8-9Mb。一般情況下，鏈黴菌對大分子多糖物質有很強的分解利用能力，如半纖維素等。因此，研究鏈黴菌對半纖維素的分解利用機制，發現全新的半纖維素酶尤其是木聚糖酶基因序列並通過轉基因對目的基因進行外源表達，對新型半纖維素酶製劑的開發及生產具有重大意義。

【發明內容】

[0007]本發明針對現有技術存在的上述不足，提出一種基於木聚糖酶的工程菌及其實現方法。
[0008]本發明是通過以下技術方案實現的:
[0009]本發明涉及一種基於木聚糖酶的工程菌，能夠外源表達內切-1，4-木聚糖酶的DH5 α大腸桿菌。
[0010]所述工程菌通過以下方式構建得到:
[0011]I)設計併合成PCR引物，自灰略紅鏈黴菌JSD-1 (CGMCC N0.5706)基因組DNA為模板進行PCR擴增；
[0012]所述的PCR引物是指含有Nde I和EcoR I酶切位點的引物，具體包括:
[0013]正向引物Xya-Nde 1-F:
[0014]5』-GGAATTCCATATGATCGGCACCGCCGTCGCCGGCGG-3』
[0015]反向引物Xya-EcoR 1-R:
[0016]5』-GGAATTCTCAGTGCTTGTGCTTCGGCCCCTTCGGCCCC-3』
[0017]所述的PCR擴增採用PrimeSTAR GXL高保真酶(TaKaRa)進行擴增，PCR擴增條件為:98°C預變性3min ;98°C變形10s，68。。延伸Imin ；30個循環後68°C終延伸3min。
[0018]2)構建具有Sg-Xya基因的質粒:將步驟I得到的PCR擴增產物切膠回收後連接至克隆載體，並導入DH5a大 腸桿菌感受態細胞；挑取具有相應抗性的克隆並通過菌落PCR進行鑑定，直至獲得陽性克隆後挑取並搖菌提取得到PET-30質粒。
[0019]所述的克隆載體採用pEASY-Blunt Simple Cloning Vector。
[0020]3)構建具有Sg-Xya基因的表達載體，具體步驟包括:
[0021]3.1)用Nde I和EcoR I雙酶切處理含有Sg-Xya基因的克隆質粒後通過瓊脂糖凝膠電泳回收含有β_1，4-木聚糖酶(Sg-Xya)基因的片段；
[0022]3.2)用Nde I和EcoR I內切酶處理ρΕΤ_30質粒，並通過瓊脂糖凝膠電泳回收載體片段；
[0023]3.3)將兩次回收的DNA片段混合，在T4DNA Ligase的作用下過夜連接，然後導入DH5 α大腸桿菌感受態細胞，挑取陽性克隆並擴大培養提取其質粒，獲得含有Sg-Xya基因的表達載體。
[0024]4)將表達載體轉化至大腸桿菌:將步驟3中得到的含有Sg-Xya基因的表達載體質粒轉入Transetta (DE3)感受態細胞內。通過具有卡那黴素抗性和氯黴素抗性的LB液體培養基進行篩選獲得陽性克隆，即含有Sg-Xya基因的工程菌。
[0025]所述的β -1, 4-木聚糖酶，其胺基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0026]所述的Sg-Xya基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其長度為1026個鹼基對，編碼341個胺基酸，分子量為39.1KD。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1目的基因PCR擴增結果電泳圖。
[0028]圖2含有目的基因的克隆載體酶切電泳圖。
[0029]圖3含有目的基因的ρΕΤ- 30載體酶切電泳圖。
[0030]圖4重組菌誘導蛋白SDS-PAGE電泳圖。【具體實施方式】
[0031]下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護範圍不限於下述的實施例。
實施例1
[0032]灰略紅鏈黴菌(Streptomycesgriseorubens) JSD -1 的培養
[0033]灰略紅鏈黴菌(Streptomyces griseorubens)分離自上海浦江鎮腐爛土壤,保藏編號為CGMCC N0.5706 ;該菌株於2012年I月9日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心中國科學院微生物研究所(地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號100101)
[0034]將該菌接種於LB液體培養基中，32°C培養60h，離心收集菌體並提取細菌的基因組 DNA。
[0035]所述的LB液體培養基組分為:蛋白腖10g、酵母提取物5g、NaC15g、去離子水1L，pH6.8-7.2ο
實施例2
[0036]灰略紅鏈黴菌內切-β -1，4-木聚糖酶(Sg-Xya)基因的克隆
[0037]通過對灰略紅鏈黴菌內切-β-1，4-木聚糖酶基因序列進行分析，設計含有Nde I和EcoR I酶切位點的引物如下:
[0038]正向引物Xya-Nde 1-F:`[0039]5』-GGAATTCCATATGATCGGCACCGCCGTCGCCGGCGG-3』
[0040]反向引物Xya-EcoR 1-R:
[0041]5』-GGAATTCTCAGTGCTTGTGCTTCGGCCCCTTCGGCCCC-3』
[0042]以灰略紅鏈黴菌JSD-1基因組DNA為模板，採用PrimeSTAR GXL高保真酶(TaKaRa)進行擴增。PCR擴增條件為:98°C預變性3min ;98°C變形10s，68°C延伸Imin ；30個循環後68°C終延伸3min。
實施例3
[0043]含有內切-β -1，4-木聚糖酶(Sg-Xya)基因克隆載體的構建
[0044]將PCR擴增產物進行電泳檢測，結果表明獲得片段約為1.3Kb(見圖1);然後將PCR產物切膠回收後連接到pEASY-Blunt Simple Cloning Vector (北京全式金)，隨後導入DH5a大腸桿菌感受態細胞。
[0045]挑取具有相應抗性的克隆，通過菌落PCR進行鑑定，直至獲得陽性克隆。挑取陽性克隆，搖菌提取其質粒後送上海桑尼生物有限公司進行測序。
實施例4
[0046]含有內切-β -1，4-木聚糖酶(Sg-Xya)基因表達載體的構建
[0047]選取序列正確的質粒，用Nde I和EcoR I雙酶切後通過瓊脂糖凝膠電泳回收含有內切-β-1，4_木聚糖酶(Sg-Xya)基因的片段(如圖2);同樣，用Nde I和EcoR I內切酶處理pET_30a表達載體，並通過瓊脂糖凝膠電泳回收較大的載體片段。
[0048]將兩次回收的DNA片段混合，在T4DNA Ligase的作用下過夜連接，然後導入DH5 α大腸桿菌感受態細胞。挑取陽性克隆，擴大培養提取其質粒便獲得含有內切_β -1，4-木聚糖酶(Sg-Xya)基因表達載體。用Nde I和EcoR I雙酶切並通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(如圖3),確認載體構建無誤。
實施例5
[0049]含有內切-β -1，4-木聚糖酶(Sg-Xya)基因表達菌株的構建
[0050]將含有內切-1，4-木聚糖酶(Sg-Xya)基因表達載體質粒轉入Transetta(DE3)感受態細胞內。通過具有卡那黴素抗性和氯黴素抗性的LB固體培養基(抗生素濃度均為25yg/mL)進行篩選獲得陽性克隆。獲得的陽性克隆便為含有內切-β-1，4-木聚糖酶(Sg-Xya)基因的表達菌株。
實施例6
[0051]內切_β-1, 4-木聚糖酶(Sg-Xya)的外源表達[0052]挑取陽性克隆並接種於含有卡那黴素和氯黴素的LB液體培養基(濃度均為25 μ g/mL)中，32°C、150rpm震蕩培養2_3h，當0D600達到0.6-0.8時，加入IPTG使發酵液中IPTG濃度達為0.1mM, 28°C、140rpm繼續培養6小時進行誘導表達。待誘導表達完成，離心收集菌體，用破胞緩衝液洗滌菌體一次，再用1/10發酵液體積的I XPBS緩衝液重懸菌體後在冰浴條件下超聲波破碎至菌液澄清，13000rpm/min離心10min收集上清,上清液即為內切-β -1, 4-木聚糖酶的粗酶液。
實施例7
[0053]重組菌誘導表達內切-β -1, 4-木聚糖酶粗酶液的SDS-PAGE
[0054]製備12%SDS-PAGE 膠，將粗酶液與 5 X SDS-PAGE Loading Buffer 比例混合，與沸水浴lOmin，每個點樣孔上樣10yL，120V電泳IOmin待條帶進入分離膠後調高電壓至160V，電泳60-70min，直至溴酚藍指示條帶完全跑出膠。停止電泳，用考馬斯亮藍R-250溶液過夜染色，然後用脫色液進行洗滌，直至背景色完全脫去，條帶清晰可見(如圖4)。
[0055]所述的12%SDS_PAGE是由濃縮膠與分離膠構成的，其組分分別為:
[0056]分離膠:蒸餾水1.6mL, 30% 丙烯醯胺溶液 2.0mL, 1.5M Tris-HCl (pH8.8) 1.3mL，10% 過硫酸銨(APS) 0.05mL, 10%SDS 溶液 0.05mL, TEMED0.002mL ；
[0057]濃縮膠:蒸餾水0.68mL，30%丙烯醯胺溶液0.17mL，1.0MTris-HCl (pH6.8) 0.13mL, 10% 過硫酸銨(APS) 0.01mL, 10%SDS 溶液 0.01mL, TEMED0.0OlmL ；
[0058]所述的5 X SDS-PAGE Loading Buffer 組分為:IM Tris-HCl (ρΗ6.8) 1.25mL,SDS0.5g，溴酚藍25mg，甘油2.5mL,去離子水定容至5mL。小份分裝(500 μ L)後與室溫保存，使用前每小份加入β -巰基乙醇25 μ L0
[0059]所述的考馬斯亮藍R-250溶液組分為:考馬斯亮藍R_2501g，異丙醇250mL，冰醋酸10OmT,,去離子水 650mL。
[0060]所述的脫色液組分為:冰醋酸IOOmL,無水乙醇50mL,去離子水850mL。
【權利要求】
1.一種基於木聚糖酶的工程菌，其特徵在於，該工程菌為外源表達內切-β -1，4-木聚糖酶的DH5 α大腸桿菌； 所述的β -1,4-木聚糖酶，其胺基酸序列如SEQ ID N0.2所示； 所述的β -葡萄糖苷酶具有Sg-Xya基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其長度為1026個鹼基對，編碼341個胺基酸，分子量為39.1KD。
2.根據權利要求1所述工程菌的實現方法，其特徵在於，包括以下步驟: 1)設計併合成PCR引物，自灰略紅鏈黴菌JSD-1(CGMCC N0.5706)基因組DNA為模板進行PCR擴增； 所述的PCR引物是指含有Nde I和EcoR I酶切位點的引物，具體包括: 正向引物Xya - Nde 1- F:
5』 - GGAATTCCATATGATCGGCACCGCCGTCGCCGGCGG - 3』 反向引物Xya-EcoR 1-R:
5』 - GGAATTCTCAGTGCTTGTGCTTCGGCCCCTTCGGCCCC - 3』 2)構建具有Sg-Xya基因的質粒:將步驟I得到的PCR擴增產物切膠回收後連接至克隆載體，並導入DH5ci大腸桿菌感受態細胞；挑取具有相應抗性的克隆並通過菌落PCR進行鑑定，直至獲得陽性克隆後挑取並搖菌提取得到PET - 30質粒； 3)構建具有Sg- Xya基因的表達載體； 4)將表達載體轉化至大腸桿菌:將步驟3中得到的含有Sg-Xya基因的表達載體質粒轉入Transetta感受態細胞內。通過具有卡那黴素抗性和氯黴素抗性的LB液體培養基進行篩選獲得陽性克隆，即含有Sg - Xya基因的工程菌。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵是，所述的PCR擴增採用PrimeSTARGXL高保真酶進行擴增，PCR擴增條件為:98°C預變性3min ;98°C變形10s，68°C延伸Imin ;30個循環後68°C終延伸3min。
4.根據權利要求2所述的方法,其特徵是,所述的克隆載體採用pEASY-BluntSimpleCloningVector0
5.根據權利要求2所述的方法，其特徵是，所述的步驟3具體包括: `3.1)用Nde I和EcoR I雙酶切處理含有Sg - Xya基因的克隆質粒後通過瓊脂糖凝膠電泳回收含有Sg - Xya基因的片段；` ` 3.2)用Nde I和EcoR I內切酶處理pET -30質粒，並通過瓊脂糖凝膠電泳回收載體片段； ` 3.3)將兩次回收的DNA片段混合，在T4DNA Ligase的作用下過夜連接，然後導入DH5 α大腸桿菌感受態細胞，挑取陽性克隆並擴大培養提取其質粒，獲得含有Sg -Xya基因的表達載體。
【文檔編號】C12N9/42GK103865868SQ201410125516
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月31日 優先權日:2014年3月31日
【發明者】周培, 馮海瑋, 支月娥, 初少華, 孫玉靜, 羅豔青 申請人:上海交通大學