單克隆抗體Fab'－平陽黴素偶聯物及其抗腫瘤作用的製作方法

2023-07-01 00:49:11 1

專利名稱：單克隆抗體Fab'－平陽黴素偶聯物及其抗腫瘤作用的製作方法
技術領域：
本發明涉及以一種單克隆抗體作為載體，偶聯攜帶抗腫瘤藥物進行抗腫瘤治的方法。
單克隆抗體(單抗)3A5是以人肝癌BEL-7402細胞免疫LOU/C大鼠後取其脾細胞與大鼠骨髓瘤IR983F細胞融合，經篩選，克隆後所得雜交瘤細胞株分泌的抗體。
據報導，小鼠單克隆抗體Fab』片段有較完整抗體更強的組織穿透力，易於到達腫瘤組織深部(Cancer Research 1991，516363)，有利於腫瘤診療。但大鼠單抗未見相似報導。以胃蛋白酶消化大鼠不同類型單抗，可獲得單抗F(ab)』2片段，但其免疫學活性和Fab』片段的製備方法及其與藥物偶聯物的研究(Journal of Immunologic methods 1983，64141)均未見報導。有報導認為，單抗3A5與多種腫瘤細胞有強免疫反應性，其與平陽黴素偶聯物體外對肝癌BEL-7402細胞具有選擇性殺傷作用(中華微生物與免疫學雜誌1991；11230)。動物實驗表明該偶聯物腔內給藥可明顯延長動物生存時間(藥學學報1997；32669)，但未見3A5活性片段與平陽黴素偶聯物的報導。抗人肺癌單抗3D3與平陽黴素以分子比1∶68相偶聯後在體外對人肺腺癌細胞的殺傷作用比游離平陽黴素強5倍，但未見動物實驗的報導(中國腫瘤臨床1996；23437)。3A5以木瓜蛋白酶降解可獲得Fab片段(藥學學報1993；28260)其與平陽黴素偶聯物及Fab』的製備則未見報導。綜上所述，迄今為止，大鼠單抗Fab』片段的製備及其與平陽黴素偶聯物的研究國內外均無報導。本項發明的研究表明，以適當的方法可以獲得有活性的單抗Fab』片斷，其與平陽黴素偶聯物對實驗動物腫瘤有顯著療效，有可能成為一種新的腫瘤治療藥物。
本發明的目的是以合適的方法製備單抗3A5Fab』片段，並將此片斷與平陽黴素相偶聯，用於臨床治療腫瘤。本項發明的內容與要點是1.單抗3A5Fab』的製備 單抗3A5用0.2mol/L的檸檬酸緩衝液調整為1-2mg/ml，pH3.7.加入適量胃蛋白酶，37℃反應6小時，產物經SephadexG-150層析純化獲得F(ab)』2。6-10mg/ml在pH7.5時可經5mmol/L二巰基蘇糖醇(DTT)還原，產物經DE-52陰離子交換層析得Fab』，其分子量約55Kd，其結構包含Fab與部分鉸鏈區。經酶聯免疫吸附測定(ELISA)，保持了對人肝癌BEL-7402細胞的免疫反應性(圖1)。小鼠抗IV型膠原酶單抗3D6，以無花果蛋白酶消化產生F(ab)』2，經β-巰基乙醇還原獲得Fab』，也保持了對IV膠原酶的免疫反應性(圖2)。
2.Fab』與平陽黴素偶聯物製備 將葡聚糖T-40(Dextran T-40)以高碘酸鈉氧化，透析，冷凍乾燥，得多醛基葡聚糖(PAD)。按重量比1∶2取PAD與平陽黴素共溶於適量磷酸鹽緩衝液(PBS)中，4℃避光反應12小時後，加入與PAD等摩爾數的Fab』，繼續反應12小時。以適量硼氫化鈉還原2小時。產物經Sephadex G-100層析純化，收集既有抗體活性又有抑菌活性部分，即為偶聯物。
3.偶聯物對細胞的殺傷作用 體外培的人體肝癌細胞BEL-7402和口腔鱗癌KB細胞，用克隆形成法測定，藥物作用1小時。結果平陽黴素對兩種細胞均有殺傷作用，抑制50％克隆形成的濃度(IC50)分別為0.51μmol/L和0.47μmol/L；偶聯物對兩種細胞IC50分別為0.02μmol/L和0.50μmol/L。表明偶聯物對BEL-7402細胞具有一定選擇性殺傷作用(圖3，圖4)。
4.偶聯物腹腔注射對小鼠結腸癌的療效 取結腸癌26瘤組織，按1∶3加入生理鹽水研磨成勻漿，按0.2ml/只接種子BALB/c小鼠腋窩皮下；接種24小時後經腹腔內注射(ip)給藥，對照組給予生理鹽水，14天後處死動物，取腫瘤稱重，計算抑瘤率。結果表明，平陽黴素和偶聯物對結腸癌26均有療效，抑瘤率分別為56％和77％，二者有顯著差異(表1)。
表1偶聯物腹腔內注射對小鼠結腸癌26的抑制作用劑量 動物數 體重(g) 瘤重(g)抑瘤率(mg/kg×次數) 開始/結束開始/結束 x±SD (％)對照 10/10 18.8/21.71.59±0.35平陽黴素5×6 10/10 18.8/20.30.71±0.4l 56*偶聯物 5×6 10/10 18.9/20.20.37±0.07 77*△皮下接種腫瘤，腹腔給藥，兩天一次；* P＜0.01與對照比較△△P＜0.01與平陽黴素組比較5.偶聯物靜脈注射給藥(iv)對小鼠結腸癌26的療效 接種方法同前所述，給藥方式為靜脈注射。動物不處死，每3天記錄體重和測瘤體積，按瘤重(mg)＝l/2長徑×短徑2計算瘤重，繪製腫瘤生長曲線並觀察動物生存時間。研究結果表明，偶聯物靜脈注射給藥對腸癌26有顯著療效，其抑瘤率分別為89％(5mg/Kg)和91％(10mg/Kg)；而游離平陽黴素在相同劑量時抑瘤率分別為70％和79％。偶聯物也可顯著延長動物存活時間(表2，表3)。
表2 偶聯物靜脈注射對小鼠結腸癌26的抑制作用劑量動物數體重(g)瘤重(g)抑瘤率(mg/kg×次數) 開始/結束 開始/結束x±SD (％)對照 10/1021.6/22.8 0.77±0.22平陽黴素 5×710/1020.9/20.4 0.23±0.09 70*10×710/1021.1/19.3 0.16±0.34 79*偶聯物 5×710/1020.9/20.3 0.09±0.02 89*△10×710/1021.4/20.4 0.07±0.02 91*△△皮下接種腫瘤，靜脈給藥，兩天一次；* P＜0.01與對照比較△ P＜0.01與平陽黴素5mg/kg組比較△△P＜0.01與平陽黴素10mg/kg組比較表3 靜脈注射給藥動物生存情況劑量 動物數 生存期中位數 生存期中位數(mg/kg×次數) (只) (天) 增加百分數(％)對照 1017平陽黴素 5×710297110×7103394偶聯物 5×710307610×71038 1246.偶聯物毒性 偶聯物與平陽黴素腹腔注射給藥(5mg/kg×6)對小鼠結腸癌抑瘤率分別為56％和77％，經病理組織學檢查，心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸及股骨均未見毒性病變。
本發明的優點與積極效果是確定了大鼠單抗Fab』製備方法並為單抗與平陽黴素偶聯物用於治療腫瘤提供了必要的依據。平陽黴素已在臨床應用多年，有較好療效，而其與單抗Fab』偶聯物對實驗動物腫瘤具有明顯優於等劑量游離平陽黴素的療效，預計將可能用於臨床腫瘤治療，並取得良好的效果。


圖1單抗3A5Fab』對BEL-7402細胞免疫反應性其中橫坐標為抗體濃度縱坐標為490吸光值1為3A52為3A5Fab』圖2單抗3D6Fab』對IV膠原酶的免疫反應性其中橫坐標為抗體濃度縱坐標為490吸光值1為3D62為3D6Fab』圖3平陽黴素及偶聯物對BEL-7402細胞的殺傷作用其中橫坐標為藥物濃度(umol/l)縱坐標為克隆形成率(％)1為平陽黴素2為偶聯物圖4平陽黴素及偶聯物對KB細胞的殺傷作用其中橫坐標為藥物濃度(umol/l)縱坐標為克隆形成率(％)1為平陽黴素2為偶聯物
權利要求
1.單克隆抗體Fab′-平陽黴素偶聯物及其抗腫瘤作用，其特徵是所說的抗腫瘤作用的實施包括以下步驟A.單克隆抗體3A5 Fab′活性片段的製備；B.3A5Fab′-平陽黴素偶聯物的製備C.3A5Fab′-平陽黴素偶聯物的抗腫瘤作用的檢測
2.按照權利要求1所述的偶聯物及其抗腫瘤作用，其特徵是所說的3A5Fab′是以胃蛋白酶消化單抗3A5產生F(ab)′2，再以二巰基蘇糖醇(DTT)還原，產生Fab′，其結構包含Fab與部分絞鏈區；單抗3D6以無花果蛋白酶消化產生F(ab)′2，經β-巰基乙醇還原獲得Fab′。
3.按照權利要求1所述的偶聯物及其抗腫瘤作用，其特徵是Fab′-平陽黴素偶聯物的製備是將葡聚糖T-40氧化成多醛基葡聚糖(PAD)，先加入平陽黴素，再加入Fab′繼續反應，經硼氫化鈉還原，純化得到產物。
4.按照權利要求1所述的偶聯物及其抗腫瘤作用，其特徵是體外培養人體肝癌細胞BEL-7402和口腔鱗璃KB細胞，用克隆形成法檢測游離平陽黴素及其偶聯物的細胞殺傷作用。
5.按照權利要求1所述的偶聯物及其抗腫瘤作用，其特徵是動物體內試驗，在BALB/c小鼠皮下接種結腸癌26，通過腹腔內和靜脈注射給藥判斷游離平陽黴素及其偶聯物的抑瘤率。
全文摘要
抗人肝癌BEL－7402細胞單克隆抗體3A5,以適當方法獲得其活性Fab'片段;以葡聚糖T－40作中介體,將Fab'與平陽黴素相偶聯,體外實驗用培養的人體肝癌BEL－7402細胞和口腔鱗癌KB細胞,克隆形成法檢測,偶聯物對二者有殺傷作用,抑制50%克隆形成的濃度分別為0.02μmol/L和0.5μmol/L,體內實驗用結腸癌26,取結腸癌26瘤組織加生理鹽水勻漿接種於Balb/C小鼠腋窩皮下,24小時後給藥,抑瘤率分別為77%(ip 5mg/kg×6,兩天一次)和89%(iv 5mg/kg×7,兩天一次)或91%(iv 10mg/kg×7,兩天一次),同時動物存活時間明顯延長,其效果優於等劑量游離平陽黴素,為單克隆抗體Fab'與平陽黴素偶聯物用於治療腫瘤提供了依據。
文檔編號C07K16/00GK1255378SQ9911080
公開日2000年6月7日 申請日期1999年7月21日 優先權日1999年7月21日
發明者甄永蘇, 劉小雲, 王維剛, 劉秀均 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所