提高雞抗NDV病毒效果的方法與流程

2023-06-28 05:52:56 1

本發明涉及一種提高禽類抗NDV病毒效果的方法。

背景技術：

新城疫(Newcastle Diseases，ND)，俗稱亞洲雞瘟、偽雞瘟，是由新城疫病毒(Newcastle diseases virus，NDV)強毒引起的主要侵害以雞為主的多種禽類的一種急性、高度接觸性的烈性傳染病。

宿主防禦肽(Host defensin peptides，HDPs)是生物體產生的一類具有廣譜抗菌活性的小分子多肽，是機體抗病原入侵的第一道防線。但在禽類體內僅發現存在β-防禦素，即禽β-防禦素(avianβ-defensins,AvBDs)。由於不同AvBDs抗病毒作用的信號轉導機制不完全一致，所以目前還無法利用禽先天性免疫系統對抗新城疫病毒。

技術實現要素：

本發明利用禽先天性免疫系統，通過人為幹預，調節抗NDV病毒信號轉導，增加雞體內抗NDV感染的禽β-防禦素分泌量，進而提高雞對NDV的抗病毒效果。

本發明提高雞抗NDV病毒效果的方法利用激動劑刺激雞體內TLR15、激活p38MAPK信號轉導通路，從而增加雞體內AvBD2的分泌量，實現抗NDV效果的提高。

本發明方法利用禽類天然免疫調控機制，提高禽機體的免疫能力，並且避免了耐藥性的發生。與使用抗生素的方法相比，應用本發明方法的雞具有更高的食用安全性。

雞處於雞胚階段，組織和器官尚未發育成熟，此時並不能調動各自的免疫體系，發揮抗NDV作用。雞胚成纖維細胞發育成熟最早，且數量大。本發明方法可以增加雞胚成纖維細胞的AvBD2分泌量，實現了雞胚階段的抗NDV。

本發明方法

具體實施方式

本發明技術方案不局限於以下所列舉具體實施方式，還包括各具體實施方式間的任意組合。

具體實施方式一：本實施方式提高雞抗NDV病毒效果的方法利用激動劑刺激雞體內TLR15、激活p38 MAPK信號轉導通路，從而增加雞體內AvBD2的分泌量，實現抗NDV效果的提高。

具體實施方式二：本實施方式與具體實施方式一的不同點是：注射ODN-M362、Pam3CSK4或FLA-ST刺激TLR15。其它步驟及參數與實施方式一相同。

具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式一或二的不同點是：注射積雪草酸(Asiatic acid)。其它步驟及參數與實施方式一或二相同。

實施例

實驗1：採用構建PCAG-his-AVBD2、PCAG-AVBD2-his(Xho I/Bam HI酶切位點)真核表達質粒，用Expi293F懸浮培養表達系統表達AVBD2蛋白，並用鎳柱純化後，進一步將不同濃度的AVBD2與NDV(F48E9毒株)相互作用1h後，接種DF-1細胞，分別於36h和48h後，用MTT試劑盒檢測細胞凋亡。

實驗1結果：表明AVBD2具有抗NDV作用。

真核細胞表達系統，完全模擬體內環境，通過真核細胞的轉錄加工，對表達的mRNA做剪切修飾，從而使表達的蛋白具有接近體內真實的構象和生物活性。Expi293F真核表達系統可以獲得大量高純度和具有生物活性的目的蛋白。因此製備真核表達質粒在DF-1細胞中進行試驗更為接近活雞防疫實際情況。同時在DF-1細胞中進行試驗也避免了活雞體內其他組織系統的幹擾，能夠真實地反映出AVBD2對於NDV的抗病毒效果。

實驗2：選9日齡SPF級雞胚製作CEF細胞(雞胚成纖維細胞)，鋪12孔板，12h後去掉培養基，PBS洗滌2次，加入無血清DMEM稀釋的NDV(F48E9毒株)，按1MOI(multiplicity of infection)比例感染，對照組為無NDV(F48E9毒株)的無血清DMEM，37℃吸附1.5h後，PBS洗滌細胞3次，加入含2％胎牛血清的DMEM培養基在37℃、5％CO2培養箱中繼續培養6、12、24、36和48h後棄掉上清，PBS洗3遍細胞後，加入1ml TRIzol提取RNA，應用螢光定量PCR方法檢測AvBDs(1～14)的基因表達量。每個時間點設置3～4個平行樣本。

實驗2結果：經NDV(F48E9毒株)感染後與對照組相比，僅AvBD2的基因表達量顯著增加p＜0.05，而其他AvBDs經攻毒後表達量變化不明顯。

雞胚成纖維細胞為雞胚(成纖維組織)細胞，不含器官和(功能性)組織。

實驗3：分別用TLRs激動劑LPS(TLR4)、ODN-M362(TLR21)、Pam3CSK4(TLR1/2)、poly I:C(TLR3)、R848(TLR7)、FLA-ST(TLR5)作用於雞CEF細胞，各激動劑的用量分別為LPS-B5——2μg/ml，ODN-M362——2.5μM，Pam3CSK4——0.4μg/ml，polyI:C——50μg/ml，R848——5μg/ml，FLA-ST——2μg/ml，對照組為只加相應劑量的H2O。將CEF細胞於37℃、5％CO2培養箱中繼續培養，並分別在培養6h、24h和48h後，棄掉培養基，PBS洗滌細胞3次，每個細胞培養孔加入1ml TRIzol提取RNA，應用螢光定量PCR方法檢測TLR15和AvBD2的基因表達量。每個時間點設置3～4個平行樣本。

實驗3結果：TLR15和AvBD2基因表達水平在ODN-M362、Pam3CSK4和FLA-ST刺激後表達量同步顯著上調，與未加激動劑的對照組比AvBD2基因表達量增加了10～30倍。

實驗4：選9日齡SPF級雞胚製作CEF鋪12孔板，12h後去掉培養基，PBS洗滌2次，加入1ml含2％胎牛血清的DMED培養基，分別加入MAPK(JNK、ERK和p38)和NF-κB通路的抑制劑SP600125(50μM)、PD 98059(50μM)、SB 203580(50μM)和PDTC(50μM)，對照組為加入相應劑量的DMSO，在37℃、5％CO2培養箱中繼續培養1h後，分別加入相應濃度的TLRs激動劑(ODN-M362 2.5μM、Pam3CSK4 0.4μg/ml、FLA-ST 2μg/ml)，繼續培養箱中培養24h，棄掉細胞上清，PBS洗滌細胞3次，加入1ml TRIzol提取RNA，應用螢光定量PCR方法檢測AvBD2的基因表達量。每個時間點設置3～4個平行樣本。

實驗4結果：僅有SB203580對AvBD2基因的表達量產生顯著的抑制作用。說明AvBD2主要通過p38MAPK通路介導產生。

實驗5：選9日齡SPF級雞胚製作CEF鋪12孔板，12h後去掉培養基，PBS洗滌2次，加入1ml含2％胎牛血清的含NDV(F48E9毒株)DMED培養基，接毒量為1MOI，分成3組，第1組只加入p38MAPK通路抑制劑SB 203580(50μM)，第2組只加入p38MAPK通路激動劑Asiatic acid(50μM)和抑制劑SB 203580(50μM)，第3組為對照組只加相應量的DMSO或水。在37℃、5％CO2培養箱中繼續培養24h，棄掉細胞上清，PBS洗滌細胞3次，加入1ml TRIzol提取RNA，應用螢光定量PCR方法檢測AvBD2的基因表達量。每個時間點設置3～4個平行樣本。

實驗5結果：第2組和第3組AvBD2基因表達水平基本相同。證明Asiatic acid能夠抵消p38MAPK通路抑制劑的作用，激活p38MAPK信號轉導通路，增加AvBD2基因表達量。