一種紫杉醇產生菌發酵紅豆杉枝葉生產紫杉醇新方法

2023-06-28 01:47:56 1

專利名稱：一種紫杉醇產生菌發酵紅豆杉枝葉生產紫杉醇新方法
技術領域：
本發明涉及一種紫杉醇產生菌株的分離選育方法和利用該菌株發酵紅豆杉枝葉 轉化紫杉醇前體物，提高紫杉醇得率的工藝技術。
背景技術：
紫杉醇是紅豆杉屬植物中的一種複雜的次生代謝產物，由紅豆杉樹幹、樹皮或針 葉中提取或半合成的有效成分，也是目前所了解的惟一一種可以促進微管聚合和穩定已聚 合微管的藥物。通過II-III臨床研究，紫杉醇主要適用於卵巢癌和乳腺癌，對肺癌、大腸 癌、黑色素瘤、頭頸部癌、淋巴瘤、腦瘤也都有一定療效。由於其作用機制獨特，對很多耐藥 病人有效，成為目前最熱門的抗腫瘤藥物之一。紅豆杉是一種生長緩慢的喬木，分布於北半球的溫帶至亞熱帶地區，我國有四種 和一個變種(南方紅豆杉)，但是全世界資源總量卻極其有限，散生分布於天然林中。目前 全世界的紫杉醇需求量在每年數十至數百噸紫杉醇純品，尋求新的來源成為主要的研究方 向。1、從紅豆杉的不同部位提取紫杉醇主要通過紅豆杉樹皮提取生產紫杉醇，但是對野生資源破壞巨大，人們試圖從紅 豆杉植株的其他部位提取以擴大紫杉醇來源，Keith Witherup測定了 6種紅豆杉枝葉和莖 中的紫杉醇含量，發現針葉中的紫杉醇含量較高。2、良種繁育、人工栽培為彌補天然資源的奇缺，國內外的工作人員進行紅豆杉良種選育和扦插快繁技術 研究，其中賓夕法尼亞大學國家天然產物技術中心已篩選出高紫杉醇含量的植株供人工栽 培，美國農業部和密西西比大學聯合栽培紅豆杉規模達數百萬株，3 5年即可收割。3、化學合成紫杉醇①全合成紫杉醇美國佛羅裡達州立大學的化學教授豪頓以樟腦為起始材料，採用線性合成法，於 1993年12月完成紫杉醇全合成；Scipps研究所1992年報告先合成兩個六元環，再將其連 續形成以八元環為中心的中間體，然後再合成四元環，從而完成紫杉醇的全合成。但是兩種 全合成途徑都包括25 30步的化學反應複雜過程，距工業化生產尚有很大距離。②半合成紫杉醇1988年，法國Denis首次報導了從歐洲紅豆杉的針葉中獲得10-乙醯漿果赤 黴素IlKbaccatin-III)，以此為原料半合成了紫杉醇及其同系物texotere。隨後美國 Rhone-Poulene Rorer化學公司也實現了紫杉醇的半合成，並申請了以baccatin-III為原 料半合成紫杉醇的專利。美國BMS公司計劃在獲得美國FDA批准後，停止從樹皮中萃取紫 杉醇的生產活動，利用半合成法進行工業化生產紫杉醇。4、利用植物細胞工程方法生產紫杉醇利用植物細胞培養法生產紫杉醇，該方法曾經一度是各種研究方向中十分有吸引力的一個方向，也是1990年美國NCI主持召開的紫杉醇研討會上，得到NCI投資的方向之 一，但是十年來沒有突破性進展。5、紫杉醇類似物目前世界各國科學家從紅豆杉屬植物中分離得到200多種化合物，都具有紫杉烷 三環二萜的基本骨架，部分具有抗腫瘤活性。綜合分析，目前國內外對紫杉醇的研究方向很多，但是沒有成型的可進行工業化 生產，主要原因為紅豆杉資源不足，栽培的樹種生長緩慢，不能短時間內提供足夠原料；紫 杉醇分子式結構複雜，很難進行化學合成的工業化生產，細胞培養方法由於發酵周期長且 高產細胞株選育耗時長，中試投產都有一定困難。於是，國內外學者開始轉向真菌發酵法生 產紫杉醇，目前遇到的關鍵問題是紫杉醇產生菌的分離和發酵液中紫杉醇含量的提高成為 技術瓶頸。

發明內容
為進行紫杉醇的工業化生產，本發明通過生產實踐，研究出一種新型的紫杉醇生 產工藝。包括以下步驟1、紫杉醇產生菌的選育採用分離自南方紅豆杉韌皮部的真菌，經過紫外線誘變， 篩選出紫杉醇前體物轉化活性強、增殖速度快的「WM20094001」號菌株作為生產菌株。2、"WM20094001，，號菌株斜面培養基配方為固體MS培養基，搖瓶培養基為液體MS 培養基，發酵培養基為液體MS培養基。3、紫杉醇生產菌發酵72h左右的發酵液用自行研製的營養液稀釋5倍後，拌入經 前處理的紅豆杉枝葉，20°C 25°C條件下處理120h左右，轉化紫杉醇前體物。4、紅豆杉枝葉處理採用熱蒸汽瞬時表面脫蠟和消毒，平鋪於發酵床上，採用通風 發酵的方式進行發酵。5、發酵後，機械攪拌成糊狀，加入三倍體積95%乙醇，攪拌均勻，靜置浸提30min， 提取液經離心去渣，於40°C以下真空乾燥，獲得浸膏狀產品。本發明的創新體現在以下幾個方面①工藝技術創新利用本發明的工藝技術，生產過程中一致保持較低溫度(40°C 以下)，不破壞紫杉醇結構，提高得率，同時不涉及原料乾燥等步驟，低能耗且無三廢排放。②原始創新選育出的紫杉醇生產菌作為唯一的生產菌株，轉化紅豆杉枝葉中的 紫杉醇前體物提高紫杉醇產率，是以前的研究從來沒有提到的。本發明採用南方紅豆杉中分離的紫杉醇產生菌，接種到經脫蠟、消毒處理的紅豆 杉枝葉材料中，進行保溫發酵，利用紅豆杉枝葉中的紫杉醇前體物生物合成紫杉醇。不僅解 決了以紅豆杉樹皮為原料的生產紫杉醇的原材料短缺問題，又規避了化學合成法的複雜化 學反應過程控制問題，利用選育的天然微生物進行發酵，細胞株選育時間短，投產容易上規 模，提取工藝簡單，徹底解決了工業化生產的各種限制因素。
具體實施例方式通過實施例對本發明進行進一步的描述實施例一
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1材料與儀器南方紅豆杉新鮮枝葉原料(六安市研誠農業科技有限責任公司提供)，氫氧化鈉、 鹽酸、葡萄糖、(NH4)2NO3 KH2PO4 MgSO4 FeSO4等均為國產分析純，馬鈴薯等從當地市 場購置。超淨工作檯、恆溫培養箱、搖床、全自動中試用不鏽鋼發酵罐(S⑶1000)、5m3儲液 罐、通風發酵池(1. 2mX0. 8mX 8m)，工業用離心機、真空乾燥設備、板框壓濾機、酒精回收設 備(JS-500)2實驗方法2. 1紫杉醇生產菌培養生產菌株細極鏈格孢「WM20094001」號菌株，由六安市西山生物技術有限責任公 司科研人員分離自大別山區生長的鮮活南方紅豆杉韌皮部，經過紫外線誘變，篩選出的紫 杉醇前體物活性最強、增殖速度最快的一個菌株。斜面種子培養基固體MS培養基。液體種子培養基液體MS培養基。發酵培養基液體MS培養基。菌液製作取活化的斜面菌種，接種於種子培養基中，每隻搖瓶接1環，在搖床上 150r/min, 25°C培養72h左右，作為種子液，按5%比例接入發酵罐進行發酵，1. 8L/min的通 氣量25°C培養72h左右，用4倍於發酵液體積的液體基本MS培養基稀釋，作為接種菌液。2. 2原料發酵(紅豆杉枝葉中紫杉醇前體物轉化)紅豆杉新鮮枝葉經過125°C蒸汽處理Imin左右，溫度冷卻至室溫後，平鋪於通風 發酵池的發酵床上，均勻噴灑紫杉醇生產用接種菌液，22°C 士3°C條件下處理120h完成發 酵過程。③將發酵後的紅豆杉枝葉，機械打碎成漿，加入3倍於漿狀物體積的95%乙醇，攪 拌均勻，靜置後分層，傾出上清液，沉澱層採用板框壓濾機壓濾，濾液與傾出的上清液合併 後離心除去雜質，進行低溫真空乾燥，獲得膏狀紫杉醇粗品，回收乙醇可循環使用。3 結論利用細極鏈格孢「WM20094001」號菌株，通過上述工藝流程進行紅豆杉新鮮枝葉處 理，獲得的紫杉醇比新鮮枝葉直接提取紫杉醇得率提高1. 2倍。實驗結果證明，採用本方法生產的紫杉醇，生產條件溫和，對紅豆杉枝葉中含有的 紫杉醇結構損傷小，同時盡最大程度的轉化了紫杉醇前體物，節約了資源，提高了紫杉醇得 率，並且能耗少，無汙染，有利於環境保護和野生紅豆杉資源。特別說明以上對本發明的優選實施例方式作了詳細說明，但本發明不限於上 述實施方式，本領域的普通技術人員還可以在不脫離本發明宗旨的前提下作出其它等效變 化和修飾。
權利要求
本發明涉及一種產紫杉醇新菌種，其特徵是所述的新菌種為從本地野生南方紅豆杉樹皮中分離篩選的菌株，該菌株於2007年委託中國微生物菌種保藏中心(CGMCC)作專利保存。
2.根據權利要求1所述的產紫杉醇新菌種發酵紅豆杉枝葉生產紫杉醇方法，其特徵是(1)菌株發酵培養基採用液體MS培養基；(2)紅豆杉枝葉處理紅豆杉新鮮枝葉經過125°C蒸汽處理Imin左右，溫度冷卻至室溫 後，平鋪於通風發酵池的發酵床上。(3)發酵培養取活化的斜面菌種，接種於液體MS培養基中，每隻搖瓶接1環，在搖床 上150r/min，25°C培養72h左右，作為種子液，按5%比例接入發酵罐進行發酵，1. 8L/min的 通氣量25°C培養72h左右，用4倍於發酵液體積的液體基本MS培養基稀釋，作為紫杉醇生 產用接種菌液，均勻噴灑於處理好的紅豆杉枝葉上，22°C 士3°C條件下通風發酵120h完成 發酵過程。(4)紫杉醇的提取將發酵後的紅豆杉枝葉，機械打碎成漿，加入3倍於漿狀物體積的 95 %乙醇，攪拌均勻，靜置後分層，傾出上清液，沉澱層採用板框壓濾機壓濾，濾液與傾出的 上清液合併後離心除去雜質，進行低溫真空乾燥，獲得膏狀紫杉醇粗品，回收乙醇可循環使用。
全文摘要
本發明公開了一種產紫杉醇菌株發酵南方紅豆杉枝葉生產紫杉醇的新方法。其特徵是產紫杉醇菌株的菌種培養採用固體MS培養基，發酵採用液體MS培養基；將紅豆杉新鮮枝葉經清洗、脫蠟、消毒處理後作為發酵主原料，發酵菌株添加液體基本MS培養基調配後接種，在22℃±3℃條件下進行發酵，發酵過程完成後再經浸提、純化、乾燥處理，獲得膏狀紫杉醇粗提物。本發明的產紫杉醇菌株培養方法簡單；發酵紅豆杉枝葉過程中對紫杉醇前體轉化效率較高，同時整個過程溫度不高於40℃，不破壞紫杉醇結構，提高了紫杉醇的提取率。
文檔編號C12R1/645GK101892162SQ201010170989
公開日2010年11月24日 申請日期2010年4月24日 優先權日2010年4月24日
發明者萬賓, 劉體雲, 李耀亭, 潘勤, 熊春盛, 程斌, 鄭蕾 申請人:程斌