抗Aβ42肽的單克隆抗體及其應用的製作方法

2023-06-28 00:04:11

專利名稱：抗Aβ42肽的單克隆抗體及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物醫藥領域。本發明涉及用於早期檢測和治療老年性痴呆 (Alzheimer'sDisease. AD)的抗體。具體而言，本發明涉及抗老年痴呆症主要靶蛋白Aβ 42 肽的單克隆抗體及其應用。
背景技術：
老年性痴呆(Alzheimer』 s Disease. AD)是一種漸進性神經退化性疾病，其主要表現為記憶功能衰減及識別能力障礙，同時伴有各種神經症狀和行為障礙，具有非常高的發病率。自1907年德國醫生Alois Alzheimer首次報導AD的症狀和病理至今已近一個世紀，AD的確切致病機理仍無定論。研究發現，AD的主要病理表現有腦內細胞外的老年斑(senile plaques)沉積、細胞內的神經原纖維纏結(neurofibrillary tangles, NFT)以及膽鹼功能缺損等，最終造成神經元損傷和壞死並最終導致海綿腦病。1984年，Glenner和Wong(1984，Biochem Biophys Res Commun, 120 (3) 885-890)發現老年斑的主要成分是一種由39至43個胺基酸殘基組成的具有摺疊構型的多肽，相對分子質量約4200，稱為β-澱粉樣蛋白(i3-amyloid，Ai3)。 1992 年，Hardy 和 Higgins (1992，Science, 256 (5054) 184-185)提出了 「Αβ 級聯假說 (amyloid cascade hypothesis) 」，認為A β的聚集和沉積能加劇神經原纖維的纏結，並導致細胞死亡，是AD形成的最主要原因。Αβ沉積發生在AD早期，且與正常大腦相比，AD患者大腦中的Αβ沉積更為嚴重和廣泛，而Αβ本身能引起氧化應激、細胞凋亡以及軸突生長異常等神經病理學變化，提示Aβ在AD的產生與發展中具有重要作用。Αβ沉積主要集中在小膠質細胞周圍，並刺激小膠質細胞釋放炎症因子，發生炎症反應，這種慢性炎症反應能夠引起細胞的裂解並釋放具有反應活性的氧化性物質，從而削弱了吞噬細胞的吞噬作用， 這樣更加劇了Aβ的沉積。A β蛋白在大腦內積聚形成纖維和斑塊(俗稱老年斑)，造成神經元損傷和壞死並最終導致海綿腦病。A β是澱粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)正常代謝的產物之一。APP基因位於人類第21號染色體長臂，由至少18個外顯子編碼，Aβ的編碼序列位於第16、17個外顯子。APP主要有兩條代謝途徑一是α -分泌酶在687與688胺基酸之間切割，將APP氨基末端671個胺基酸的可溶性多肽sAPP α釋放到胞外，由於切割位點在A β序列內，因此不產生完整的A β片段；另一條途徑是經β-分泌酶在671與672 胺基酸之間切割，然後由g_分泌酶在APP的跨膜區切割，釋放出A β 40、Α β 42、Α β 43，正常情況下多數為Αβ 40(90% )，只有少量Αβ42和Αβ43產生。Wiltfang等(2007，Journal ofNeurochemistry, 101 (4) 1053-1059)發現，A β 40肽和A β 42肽的比例失調，是造成老年痴呆的重要原因之一。APP的代謝和Αβ的產生受到多種因素的調節。對早期發病AD的遺傳學研究發現，大部分AD與第21號染色體上的APP基因突變相關，為揭示A β和APP在AD病理發展中的作用提供了強有力的證據。AD突變位於APP的第670和671密碼子，能增強β -分泌酶的活性。突變位於APP的第612個密碼子，能抑制α-分泌酶的剪切活性。這兩種突變的結果使更多的APP由β -分泌酶途徑代謝，產生大量的A β。經細胞產生並釋放至胞外的A β將在適當的條件下聚集。Αβ的聚集主要有兩個步驟，即核心形成和聚集體擴大。核心形成是Αβ聚集過程中的限速步驟。Αβ 42具有較強的自我聚集能力，是核心的主要成分。因此，Αβ 42肽是治療老年痴呆症的主要靶點。Αβ的毒性主要表現在(1)Αβ能與細胞表面的許多受體結合，如神經NGF的低親和力受體ρ75、 高級糖基化終產物的受體，從而激活胞內的caspase信號通路，誘導神經元凋亡。Αβ還能改變線粒體膜的通透性，導致細胞色素c由線粒體釋放到胞漿並與凋亡蛋白酶激活因子結合，參與激活caspase通路，引起細胞凋亡。(2)Αβ的毒性一部分是通過小膠質細胞之類的非神經元細胞來介導，在神經斑周圍通常能夠發現被激活的小膠質細胞。膠質細胞的活化導致白介素-I(IL-I)的過度表達和釋放，繼而誘發IL-6、腫瘤壞死因子-a (TNF-α )、 Y-幹擾素(INF-Y)等細胞因子的表達，還能誘導補體、黏附分子、急性期蛋白、氧自由基、 前列腺素、一氧化氮等生成增加，這些分子通過作用於膠質細胞或神經元，促使其他炎症分子的產生，這種交互作用促成了慢性炎症產物分別在AD病理損傷的不同階段起作用，並貫穿其病理發展的全過程。(3)Αβ能降低Na+和K+-ATP酶的活性，從而改變膜的極性和流動性，並通過幹擾L-型電壓依賴性的Ca2+通道來破壞細胞內鈣的動態平衡。另外，Αβ能引起蛋白質過氧化和脂質過氧化，破壞超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)，從而降低細胞抵禦氧化應激的能力。(4) AD患者腦中的能量代謝變化早於老年斑等主要病理表現的產生。試驗發現Αβ不僅能破壞線粒體膜，還能直接作用於線粒體內的三羧酸循環和電子傳遞鏈，減少ATP的產生。能量代謝的損傷將進一步誘導氧自由基和鈣超載，三者之間相互影響而形成惡性循環，最終導致包括AD在內的神經退行性疾病。(5)Αβ可以作用於興奮性胺基酸受體-NMDA (N-methyl-D-aspartiate)，增加該受體對興奮性胺基酸，如穀氨酸的敏感性，導致帶有該受體的神經元被內源性穀氨酸損害。由於機體自身存在有效的清除機制，A β的產生和清除在生理條件下能保持動態平衡；而在AD病理過程中，Αβ的產生和清除之間失去平衡。近年來人們開始認識到遲發性 AD與腦內Αβ的清除減少密切相關。腦內Αβ的清除主要包括細胞外降解、細胞內吞和轉運清除。(1)細胞外降解。Αβ的降解有多種酶的參與，它們在Αβ的不同位點發揮作用， 不同腦區(皮質和海馬)和不同狀態(可溶性或不溶性、單體或寡聚體)的Αβ由不同的酶降解，任何一種降解酶的功能障礙都有可能成為引發AD的危險因素。(2)細胞內吞。Αβ 的細胞內吞由低密度脂蛋白受體相關蛋白(low-density lipoprotein receptor related protein,LRP)和清道夫受體(scavenger receptor, SR)介導。LRP介導可溶性Αβ複合物的內吞，SR介導小膠質細胞對纖維化A β的內吞。隨年齡增長，LRP的表達呈現進行性下降，在AD患者尤其明顯。(3)轉運清除。腦內Αβ的轉運清除包括血腦屏障轉運和經非特異性腦間質液泵流到腦脊液後進入血流而清除。腦內絕大多數的Αβ是經血腦屏障轉運出腦，10% -15%的Αβ由腦間質液泵流清除。這兩種方式都與LRP有關，LRP基因缺失後動物腦內Aβ成倍增加。由於認識到Αβ在AD發病過程中作用的基礎上，研究者不斷設計出各類幹擾Αβ 病變的方法，延緩或阻止AD的進程。Αβ的毒性受其數量、聚集程度和清除速度的影響，因此可以通過減少Αβ生成、防止Αβ聚集和沉積、幹預Αβ的毒性。單克隆抗體技術是抗體製備的經典方法，該技術比較成熟，應用廣泛。
本發明人旨在利用單克隆抗體與A β特異性結合，達到防止和排除Αβ聚集和沉積，促進小膠質細胞對A β的吞噬，從而實現對老年性痴呆的早期診斷和治療。

發明內容
本發明的目的在於提供能用於早期檢測和治療老年性痴呆的抗體。本發明的發明原理和發明思路為利用生物合成的方法，製備全長Αβ 42肽及其片段(包括N端片段、中間片段和C端片段)免疫小鼠，用免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞進行融合，製備雜交瘤細胞株，得到特異性抗A β 42肽的單克隆抗體。本發明提供了能夠用於早期檢測和治療老年性痴呆的單克隆抗體。一方面，本發明提供了具有選自下列可變區的的單克隆抗體(a)重鏈可變區包括SEQ ID NO 3所示胺基酸序列；(b)輕鏈可變區包括SEQ ID NO 4所示胺基酸序列；(c)重鏈可變區包括SEQ ID NO 3所示胺基酸序列，且輕鏈可變區包括SEQ ID NO 4所示胺基酸序列；(d)重鏈可變區與SEQ ID NO 3所示胺基酸序列具有至少90%同一性；或(e)輕鏈可變區與SEQ ID NO 4所示胺基酸序列具有至少90%同一性。一個優選的實施方案中，所述單克隆抗體的重鏈可變區胺基酸序列為SEQ ID NO 3，輕鏈可變區胺基酸序列為SEQ ID NO :4。另一方面，本發明提供了具有選自下列可變區的單克隆抗體(a)重鏈可變區的編碼基因包括SEQ ID NO 1所示核苷酸序列；(b)輕鏈可變區的編碼基因包括SEQ ID NO 2所示核苷酸序列；(c)重鏈可變區的編碼基因包括SEQ ID NO 1所示核苷酸序列，且輕鏈可變區的編碼基因包括SEQ ID NO :2所示核苷酸序列；(d)重鏈可變區的編碼基因能與SEQ ID NO :1所示核苷酸序列在嚴謹條件下雜交；或(e)輕鏈可變區的編碼基因能與SEQ ID NO :2所示核苷酸序列在嚴謹條件下雜 、-父。一個優選的實施方案中，所述單克隆抗體的重鏈可變區的編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO :1，輕鏈可變區的編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO :2。另一方面，本發明提供了重組表達載體，其中含有編碼本發明所述單克隆抗體可變區的核酸序列。另一方面，本發明提供了宿主細胞，所述宿主細胞被本發明所述的重組表達載體所轉化。另一方面，本發明提供了雜交瘤細胞系，其分泌產生本發明所述的單克隆抗體。本發明實驗證明，本發明提供的單克隆抗體具有高親和力，能與老年性痴呆腦組織特異性結合，而不結合正常腦組織。因此，本發明所述單克隆抗體可用於診斷老年性痴呆，特別是老年性痴呆的早期診斷。在老年性痴呆患者腦內，小膠質細胞除了清除凋亡壞死的細胞碎片外，還具有吞噬和清除Αβ沉積的功能。小膠質細胞能夠有效地吞噬澱粉樣Αβ纖維和斑塊(DeWitt 等，1998，ExpNeurol，149 329-340)。進一步研究表明在患有AD的小鼠模型中，主動產生 (Schenk 等，1999，Nature，400 173-177)或被動免疫(Bard 等，2000，Nat Med, 6 :916_919 ； Wilcock等，2003，JNeurosci，23 :3745_3751.)的抗Αβ抗體，都可以直接進入大腦，並且通過增強吞噬作用消除A β沉積。本發明對製備的抗體進行了 Ν9小膠質細胞吞噬實驗，同時把與人抗體無同源性的小鼠抗幽門螺旋桿菌的抗體和小鼠抗結核桿菌的抗體設定為同型對照抗體。本發明實驗證明本發明所述抗體能顯著增強小膠質細胞對A β 42肽的吞噬作用。現在開發的抗Αβ42肽線性化表位的抗體有三種類型(WekSler，2004，Immun. Ageing，l :2.)，即針對Αβ42Ν端片段，C端片段以及中間片段的抗體。研究人員發現，結合 N端表位(l-7aa)的抗體既可以在體外聚合A β，也能結合患者體內的大腦部位、血管沉積處以及未被剪切加工的前體蛋白ΑΡΡ。研究人員報導，這些抗體可以直接進入大腦，結合大腦的澱粉樣沉積，溶解斑塊並且可以完成Fc依賴的細胞吞噬，進而被小膠質細胞吞噬並降解。同樣證明，只有針對Αβ l_5aa(或3_7aa)的抗體才能在體內有效的結合A β沉積，針對其他表位的抗體雖然在體外可以有效地結合Αβ，但是在體內無法有效的行使功能。(Bard 等，2000，Nat. Med, 6 :916_919 ；Bard 等，2003，Proc. NatlAcad. Sci. USA, 100 :2023_2028·)本發明通過抗原表位鑑定實驗證實本發明的抗體特異性結合N端A β 42 (l-9aa) 線性表位，從而進一步佐證了本發明所述抗體能增強小膠質細胞介導的吞噬作用，溶解和清除A β沉積。因此，另一方面，本發明提供了一種用於治療老年性痴呆的藥物組合物，包括作為活性成分的本發明所述的單克隆抗體和藥用載體。另一方面，本發明提供了一種針對老年性痴呆的早期診斷試劑，包括本發明所述的單克隆抗體、能夠產生可檢測信號的標記物以及使用說明書。另一方面，本發明提供了本發明所述單克隆抗體在製備用於治療老年性痴呆的藥物中的用途。另一方面，本發明提供了本發明所述單克隆抗體在製備老年性痴呆診斷試劑中的用途。


圖1圖示的是Ν9小膠質細胞對A β 42肽的吞噬情況。圖2圖示的是同型對照抗體(亞型IgGl)對Ν9小膠質細胞吞噬作用的影響圖3圖示的是在抗體1Η3 (亞型IgGl)作用下，Ν9小膠質細胞對A β 42肽吞噬作用得到增強的情況。圖4圖示的是不同濃度的A β 42肽與0. 05ug/ml的抗體競爭抑制ELISA結果。本發明的優勢之處在於除另有說明外，本申請中的所有科技術語的都具有與本發明所屬領域普通技術人員通常理解相同的含義。儘管與本申請中描述類似或等同的方法及材料都可用於實施或檢驗本發明，但是下文仍還是對合適的方法和材料進行了描述。本申請中引用的全部出版物、 專利申請、專利及其他參考文獻其全部內容在此引入作為參考。如有牴觸，包括定義，以本申請為準。下列實施例旨在進一步舉例說明實現本發明的具體方式，而決不構成對本發明的限制。本領域技術人員應該理解的是，在不違背本發明的精神和原則的前提下，對本發明進行改動得到的技術方案都將落入本發明的待批權利要求範圍內。
實施例在本申請中，如無特別說明，本發明的實施都使用分子生物學、微生物學、重組 DNA和免疫學的常規技術，這些技術都是本領域技術人員所掌握的。這些技術在本領域技術人員常用文獻中有詳細地描述，例如Sambrook等人編著的Molecular Cloning =A LaboratoryManual，^ΙΗ ^。實施例IA β 42肽及其片段的合成根據A β 42 肽的公開序列(Genebank :ΑΒ066441. 2 ；PMID =8248178)人工合成全長 A β 42及其片段(包括N端片段、C端片段及中間片段)，全長A β 42及其片段由吉爾生化 (上海)有限公司合成。實施例2單克隆抗體的製備2.1小鼠免疫全長A β 42直接免疫，A β 42片段與KLH偶聯後分別免疫小鼠，免疫方法如下初次免疫50ug抗原加等體積氟氏完全佐劑乳化後，腹腔注射小鼠，注射體積 500ul/只。兩周後，第二次免疫50ug抗原加等體積氟氏不完全佐劑乳化，腹腔注射小鼠， 注射體積500ul/只。兩周後，採小鼠尾靜脈血，離心取血清測效價(用ELISA方法檢測)。 效價達一萬以上的小鼠，在融合前三天取抗原25ug加強免疫，注射體積200ul/只。加強免疫兩周後，採小鼠尾靜脈血離心取血清測效價(用ELISA方法檢測)。效價達一萬以上的小鼠融合前三天取抗原25ug加強免疫，注射體積200ul/只。2. 2細胞融合將培養至對數生長期的SP2/0細胞上清倒掉，加入RPMI1640不完全培養基吹打細胞。(在融合前2周培養SP2/0細胞，培養基內含8-氮鳥嘌呤)計數，2X107。收集細胞， IOOOrpm, IOmin0用20毫升RPMI1640將細胞懸起放入培養箱。摘小鼠的眼球，用EP管收集小鼠的血。將小鼠斷頸處死，放入75%酒精浸泡五分鐘左右。先用一套剪刀，鑷子剪開小鼠的皮毛。再用一套剪刀，鑷子取其脾臟。將小鼠脾臟先放入無篩網的培養皿中，用鑷子將其脾臟懸於培養皿上方，用無血清RPMI1640培養基進行衝洗。再加入無血清RPMI1640於有篩網的培養皿中，用針芯碾磨。用離心管收集脾細胞，離心，1000rpm，10min。用SP2/0懸液和離心下來的脾細胞懸在一起，離心，IOOOrpm, IOmin0將管慢慢倒立，將上清輕輕的倒掉。 上清倒掉後(除去液體殘留)，在手掌上輕擊融合管底，使沉澱細胞鬆散均勻，置37°C水浴中預熱。用Iml吸管在1分鐘加預熱至37°C的50% PEG15001ml，邊加邊輕輕攪拌滴完後靜置2min。用IOml吸管加35ml預熱至37°C的不完全培養基，(每隔1分鐘分別加入Iml, 3ml, 5ml和10ml)。離心，900rpm，8min。將上清倒掉，用彎頭滴管取含HAT完全培養基加入裝有細胞的離心管中，輕輕用彎頭滴管將細胞懸起，用八道孔排槍加板，鋪10塊板，200ul/ 孔，加完板後放入5%的二氧化碳培養箱中。第三天半定量換含HAT的完全培養，第七天換成含HT的完全培養基，第十天換成完全培養基，換液後第三天進行ELISA檢測，篩選出針對A β 42肽N端的抗體。實施例3Dot blot 和 Western blot 實驗3. IDot blot 實驗將IOng合成的Αβ 42肽(吉爾生化公司合成)點到PVDF膜上，60°C烘乾，5%脫脂奶粉封閉lh，然後放入實施例2製備抗體的不同稀釋度的稀釋液中，室溫孵育lh，TBST洗3 次後，與1 2000倍稀釋的HRP羊抗鼠抗體室溫孵育30min，洗滌3次加入ECL發光試劑， 暗室中X光片曝光。掃描光片記錄DOT Blot實驗結果。3. 2flfestern blot 實驗3. 2. ITrieine SDS PAGE 電泳由於A β 42肽只有42個胺基酸殘基，相對分子量為4200，常規SDS-PAGE無法做出清晰的條帶。本實驗中我們採用Tricine SDS PAGE電泳。制膠用所有試劑配製根據ShSgger &vonJagow(Anal Biochem. 1987,166 :368-79 ；Acta Farm. Bonaerense,2002, 21 (1) :57-60) 提供的方法。分離膠為16. 5% T，3% C的聚丙烯醯胺凝膠，濃縮膠為5% T，3% C的聚丙烯醯胺凝膠。樣品用上樣緩衝液稀釋到100 μ g/ml，每個樣品槽加樣10微升，20mA恆流約 30min，樣品到達分離膠時，將電流調至40mA，直至樣品離膠的下邊沿Icm左右，停止電泳。3. 2. 2轉膜，與抗體孵育及發光本實驗室採用半乾轉移法，將A β 42肽轉移到PVDF膜上。將膠、濾紙、PVDF膜分別在電極緩衝液中浸泡後，按濾紙，膠，PVDF膜，濾紙的順序鋪到轉移電泳槽中，1.2mA/ Cm2PVDF膜的比例調節電流進行半乾轉移，2h後，停止轉膜。將PVDF膜放入5 %脫脂奶粉溶液中室溫封閉lh。與不同稀釋度的12種抗體孵育lh，洗滌3次後與1 2000倍稀釋的 HRP標記羊抗鼠抗體孵育30min，洗滌，加ECL發光試劑，暗室中X光片曝光。掃描光片記錄 Western Blot 結果。實施例4細胞吞噬實驗4. IFITC 標記 A β 42 肽A β 42肽溶於DMS0，然後用碳酸鹽緩衝液(CBS ρΗ 9. 6)稀釋到2. 5mg/ml。按每毫克A β 42肽60微克FITC的比例加入FITC，室溫避光條件下搖動池。用含有NaN3的Tris 緩衝液透析過夜，中間換4次透析液。4. 2細胞培養將Ν9小鼠小膠質細胞培養於含IOuM β -巰基乙醇、5% FBS的IMEM培養基(購自GIBC0)中，待細胞生長到80%時，胰蛋白酶消化，進行傳代培養。將處於對數生長期的 Ν9小膠質細胞，消化後加入到M孔板中進行培養，每孔1 X IO5個細胞，培養過夜，細胞貼壁後進行試驗。4. 3Ν9小膠質細胞對A β 42肽的吞噬作用用1 μ g/ml的FITC標記的A β 42肽單獨與Ν9小膠質細胞孵育，37°C,5% CO2培養箱中培養30min。收集細胞，用流式細胞儀檢測N9小膠質細胞內螢光強度結果，並分別與不加A β 42肽的Ν9小膠質細胞進行比較，計算出螢光陽性細胞百分比，從而來確定Ν9小膠質細胞對A β 42肽的吞噬作用。檢測結果顯示(如圖1) :Αβ 42肽在1 μ g/ml時就可以引起Ν9小膠質細胞1.79% 的吞噬作用(與空白對照組比較)，因而在後續的試驗中A β 42肽的濃度都是1 μ g/ml，並且用1 μ g/mlFITC標記的A β 42肽單獨作用Ν9小膠質細胞作為陰性對照。4. 4同型對照抗體對Ν9小膠質細胞吞噬作用的影響本實驗中，為了排除無關抗體對Ν9小膠質細胞的吞噬作用存在影響的可能性，設計了小鼠抗結核桿菌TB抗體(亞型分別為IgGl)作為同型對照抗體，同型對照抗體與人體內的抗體無同源性。對照抗體與FITC標記的Αβ 42肽共同孵育Ih後作用於Ν9小膠質細胞。用上述同型對照抗體與1 μ g/ml A β 42共同孵育Ih後，對Ν9小膠質細胞吞噬作用的影響。結果顯示(如圖2)同型對照抗體小鼠抗結核桿菌TB抗體在10 μ g/ml以下時對 N9小膠質細胞的吞噬作用的影響不顯著。由此可見，無關抗體濃度低於10 μ g/ml時(與陰性對照組比較)，對N9小膠質細胞的吞噬作用影響不顯著。4. 5抗體株1H3對N9小膠質細胞吞噬作用的影響將1 μ g/ml的FITC標記的A β 42肽分別與5、10 μ g/ml的抗體分別混合後，37 V 孵育lh。加入到培養N9小膠質細胞的M孔板中，37°C，5% CO2培養箱中培養30min。收集細胞，用流式細胞儀進行檢測。測試抗體孵育後，對N9小膠質細胞吞噬作用的影響。結果顯示，抗體1H3與Αβ 42肽共同孵育組，Ν9小膠質細胞吞噬Aβ 42肽的能力比單純的Αβ 42肽組提高了 8.9% (如圖3)。這說明抗體株1Η3可以顯著促進Ν9小膠質細胞對A β 42的吞噬作用。4. 6流式細胞儀檢測0. 05%胰蛋白酶消化後收集各組細胞，1%BSA FBS洗滌兩次後，流式細胞儀檢測， 以螢光強度為橫坐標，以細胞數為縱坐標，並與陰性對照組比較，計算出陽性細胞百分比。 每次試驗都設只加A β42肽的陰性對照組和不加42肽及其抗體的空白對照組。為了排除非特異性結合，在實驗中設有無關的小鼠抗結核桿菌TB抗體作為同型對照。實施例5抗體親和力實驗將Αβ42肽稀釋至100ng/ml，酶標板每孔加入lOOul，4°C包被過夜，PBST洗滌3 次，37°C 5% BSA封閉2h，PBST洗滌3次，晾乾備用。Aβ 42肽從lug/ml開始倍比稀釋，然後加入終濃度為0. 05ug/ml的單克隆抗體 1H3，混勻，4°C孵育過夜。IOOul混合液加入包被好的酶標板條，ELISA方法檢測0D495。按公式KJ (A0-A) = 1+1(/ ，其中Atl為無A β 42肽時測的OD值，A為不同濃度A β 42肽時測的 OD值，K為親和力常數，為A β 42肽濃度，分別求出K值，計算其平均值為親和力常數。不同濃度的A β 42肽與0. 05ug/ml的抗體競爭抑制ELISA結果所示(如圖4)，從圖中可以看出，Αβ 42肽在0. 03125ug/ml時就明顯抑制抗體與包被抗原的結合。通過計算單克隆抗體1H3的親和力常數為K1H3 = 0. 040ug/mL·由此可見，本發明所述的單克隆抗體1H3具有高親和力。實施例6抗體序列測定對1H3單克隆抗體的編碼基因測序，其結果為重鏈可變區(VH)編碼基因的核苷酸序列如SED ID NO :1所示，抗體輕鏈可變區(VL)編碼基因的核苷酸序列如SEDID NO 2 所示。相應編碼的重鏈可變區(VH)胺基酸序列為SED ID NO :3，輕鏈可變區(VL)胺基酸序列為 SED ID NO :4ο 實施例7免疫組織化學實驗本實驗中，以老年痴呆症小鼠模型的腦組織進行免疫組化實驗，並以正常小鼠腦組織作為陰性對照組。將組織切成4-6um厚度的切片，放於聚-L-賴氨酸封閉的或者超霜凍的顯微載玻片上；在冷風乾燥器裡乾燥至少30min ；乾燥過的組織塊立即使用，或者置於密封盒子裡於-20°C或_80°C保存。將乾燥過的組織塊置於含有4%多聚甲醛、0.5%葡萄糖的PBS中固定lOmin， PBS-S中漂洗一次。在H2O2A). 02% NaN3的PBS-S中浸泡30min，抑制內源性過氧化物酶活性，用PBS-S漂洗玻片。在封閉液中浸泡IOmin以封閉非特異性結合位點；將多餘的封閉液吸掉，加入2-5μ g/ml的稀釋於PBS-BSA-S的一抗，4°C孵育過夜；用PBS-S漂洗3次，每次5min ；吸乾多餘的PBS-S，加入2-5μ g/ml HRP標記的二抗，室溫孵育30_60min ；用PBS-S 漂洗3次，每次5min ；加入新配製的二氨基聯苯胺3-5min，在一抗結合部位會出現棕黃色沉澱。流水衝洗5min，蘇木紅染液染色Imin ；分別用70，96，100%的乙醇進行脫水，二甲苯透明、中性樹膠封片、鏡檢。結果顯示1H3抗體與正常腦組織無非特異性結合，而與小鼠老年痴呆模型腦組織的斑點特異的結合。實施例8抗原表位鑑定分別用人工合成的多肽A β 42的3種片段，CV-9 (32_40aa)、CA-9 (34_42aa)和 DC-9 (l-9aa)，包被酶標板，常規ELISA方法測抗體1H3的0D，檢測抗體1H3與3種多肽片段結合情況，從而決定抗體的抗原表位。抗體1H3與不同肽段結合情況證明該抗體都與DC-9結合，而與其它肽段不結合， 說明這株種抗體抗原表位是A β 42肽的1-9個胺基酸殘基，即是針對A β 42肽N端抗體。
權利要求
1.一種具有選自下列可變區的的單克隆抗體，(a)重鏈可變區包括SEQID NO :3所示胺基酸序列；(b)輕鏈可變區包括SEQID NO :4所示胺基酸序列；(c)重鏈可變區包括SEQID NO :3所示胺基酸序列，且輕鏈可變區包括SEQ ID NO 4 所示胺基酸序列；(d)重鏈可變區與SEQID NO 3所示胺基酸序列具有至少90%同一性；或(e)輕鏈可變區與SEQID NO :4所示胺基酸序列具有至少90%同一性。
2.權利要求1所述的單克隆抗體，其中所述的重鏈可變區的胺基酸序列為SEQID NO 3，且其中所述的輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO :4。
3.權利要求2所述的單克隆抗體，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列的編碼核苷酸序列為SEQ ID NO :1，所述輕鏈可變區的胺基酸序列的編碼核苷酸序列為SEQ ID NO :2。
4.一種重組表達載體，其中含有權利要求3中所述的核苷酸序列。
5.一種宿主細胞，該宿主細胞被權利要求4所述的表達載體所轉化。
6.一種雜交瘤細胞，其分泌產生權利要求1至3中任一項所述的單克隆抗體。
7.一種用於治療老年性痴呆的藥物組合物，包括作為活性成分的權利要求1至3中任一項所述的單克隆抗體和藥用載體。
8.一種用於早期診斷老年性痴呆的試劑，其中包括權利要求1至3中任一項所述的單克隆抗體、能夠產生可檢測信號的標記物以及使用說明書
9.權利要求1至3中任一項所述的單克隆抗體在製備用於治療老年性痴呆的藥物中的用途。
10.權利要求1至3中任一項所述的單克隆抗體在製備老年性痴呆早期診斷試劑中的用途。
全文摘要
本發明屬於免疫生物學領域。本發明提供了一種抗老年性痴呆Aβ42肽的單克隆抗體，該抗體與Aβ42肽結合力較強，並能顯著促進小膠質細胞對Aβ42肽的吞噬作用，溶解和清除Aβ沉積，提示所述單克隆抗體能夠有效用於老年性痴呆的早期診斷和治療。
文檔編號C12N15/63GK102329393SQ20111027748
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月19日 優先權日2011年9月19日
發明者葉慶煒 申請人:徐州逸仕生物技術有限公司