芽孢桿菌芽孢的純化方法與流程
2023-06-20 09:52:51 2
本發明涉及一種微生物芽孢製備領域，具體涉及一種芽孢桿菌芽孢的純化方法。
背景技術：
芽孢是在一定條件下，細菌的細胞質高度濃縮脫水所形成的一種抗逆性很強的休眠體，其具有極強的抗逆性，可耐受高溫、低溫、乾燥、化學藥物、營養缺乏等惡劣環境；依據其特點，芽孢桿菌的芽孢在各領域被廣泛應用。
由於芽孢桿菌的芽孢在顆粒料、粉料的加工過程中以及酸性環境中具有較高穩定性，儲藏時間長，部分益生芽孢桿菌芽孢作為微生物添加劑，被用於飼料添加劑、口服益生菌製劑等，如枯草芽孢桿菌。同時，芽孢作為目前整個微生物界中抗逆性最強的生命體，在抗熱，抗化學藥物和抗輻射等方面，抵抗力極強，因此是否能消滅芽孢是衡量各種消毒滅菌手段的最重要的指標。
生物指示劑以芽孢為指示菌株，用以監測消毒滅菌效果，是判斷滅菌效果的金標準。比如，嗜熱脂肪芽孢桿菌(ATCC 7953)芽孢被用於監測壓力蒸汽滅菌、過氧化氫低溫等離子體滅菌等，枯草芽胞桿菌黑色變種(ATCC 9372)芽胞被用於監測環氧乙烷滅菌、乾熱滅菌等。
芽孢的純度及芽孢抗力是準確評價各種因子對醫療器械消毒與滅菌效果的前提。依據中國藥典及美國藥典的要求，生物指示劑中的芽孢數量、芽孢與菌體營養細胞的比例必須達到一定程度，才能較好的反映滅菌效果。
目前，芽孢生產製備的方案較多，主要集中在提高產孢數量和芽孢產率方面，但芽孢率均未能達到100％。因此，為達到更充分的利用效果，需要對生產製備的芽孢進行分離純化，除去其中的細菌營養細胞、其他培養基殘留營養、及菌體裂解產生的酶等芽孢活化因子(誘導芽孢轉化為營養細胞)。
在現有研究文獻中，將達到一定芽孢率的芽孢、菌體混合物收集，採用如下方法純化芽孢：
(1)離心法：如將混合物2000rpm離心，(芽孢為白色，菌體及培養基雜質近乎灰色)，芽孢位於離心管底部，菌體雜質位於芽孢上面，通過用小心刮取，去除菌體雜質。
(2)熱激法：將裝載混合物的離心管，置於100℃水浴，加熱5min。離心3次，去除上清，獲得芽孢沉澱。
(3)玻璃珠破碎法：將混合物中加入玻璃珠，渦旋震蕩，破碎5min不等。再紗布過濾，收集後離心洗滌3次，懸於純水，4℃保存。
上述三種方法缺點分別為：(1)離心法：操作可控性差。(2)熱激可能激活芽孢，使之發芽轉化為營養細胞。(3)玻璃珠破碎法：芽孢損失嚴重。且這三種方法的操作性較差，純度不能達到100％，工藝放大衰減嚴重，重現性較差。
技術實現要素：
針對現有技術的不足之處，本發明的目的在於提出一種芽孢桿菌芽孢的純化方法，其在不損傷芽孢，保證芽孢抗力的前提下，去除芽孢懸液中的培養基殘留營養、菌體營養細胞及破裂營養細胞釋放的蛋白酶等活性物質，保證芽孢在水溶液中長期保存。
為實現上述目的，本發明的技術方案概述如下：
一種芽孢桿菌芽孢的純化方法，其包括以下步驟：
1)無菌水洗滌：將芽孢桿菌芽孢粗品用無菌水在5000rpm、4℃下離心洗滌；並將芽孢桿菌芽孢的濃度調節至105-108/mL，得到芽孢菌體混合液；
2)重鹽洗滌：向所述芽孢菌體混合液中加入5-15倍重量的重鹽洗液，混勻，在5000rpm、4℃下離心，去上清，得沉澱一；
3)酶溶液孵育：向所述沉澱一中加入酶消化液，懸浮沉澱，調節芽孢濃度至104-106/mL，37℃水浴加熱1h後，在5000rpm、4℃下離心，去上清，得沉澱二；
4)表面活性劑溶液洗滌：向所述沉澱二中加入表面活性劑溶液，使芽孢濃度達到104-106/mL，混勻後，在5000rpm、4℃下離心，去上清，得沉澱三；
5)酶抑制劑溶液洗滌：向沉澱三中加入酶抑制劑溶液，混勻後，在5000rpm、4℃下離心，去上清，得沉澱四；
6)無菌水洗滌：向所述沉澱四加入無菌水(洗去殘留的洗滌劑和雜質)，震蕩混勻後，在5000rpm、4℃下離心，去上清，得沉澱五；再次加入無菌水，混勻，置於80℃水浴中滅菌20min，離心；最終得到的芽孢桿菌芽孢以無菌水混懸，保存。
優選的是，所述的芽孢桿菌芽孢的純化方法，其中，所述高鹽溶液包括有1M的KCl、0.5M的NaCl和無菌水。高鹽溶液的作用是改變滲透壓，使菌體脫水。
優選的是，所述的芽孢桿菌芽孢的純化方法，其中，所述酶消化溶液包括有50μg/ml的溶菌酶和無菌水。溶菌酶有破壁的功能，能去除菌體。
優選的是，所述的芽孢桿菌芽孢的純化方法，其中，所述表面活性劑溶液包括有0.05wt％的十二烷基硫酸鈉和無菌水。表面活性劑溶液可使蛋白變性，從而去除營養物質及菌體裂解物質。
優選的是，所述的芽孢桿菌芽孢的純化方法，其中，所述酶抑制劑溶液包括有50mM的Tris-HCl緩衝液、10mM的EDTA、2mM的苯甲基磺醯氟和無菌水。酶抑制劑溶液的作用是抑制酶活性、除去離子等。
優選的是，所述的芽孢桿菌芽孢的純化方法，其中，所述高鹽溶液還包括有0.1M的ZnCl2。
優選的是，所述的芽孢桿菌芽孢的純化方法，其中，所述高鹽溶液還包括有0.1M的AlCl3。
本發明的有益效果是：
1、本案在保證製備的芽孢數量的同時，極大提高了芽孢純度；
2、通過本案純化方法可有效去除菌體營養細胞、培養基殘留物質及破裂營養細胞釋放的蛋白酶等活性物質，有效避免上述物質對芽胞的誘導轉化；更利於芽孢懸液在水溶液中的長期保存；
3、本工藝操作簡單，工藝易於放大，衰減小，重複性好，易於工業化生產。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。
實施例1
一種芽孢桿菌芽孢的純化方法，其包括以下步驟：
1)無菌水洗滌：將芽孢桿菌芽孢粗品(投放量1g)用無菌水在5000rpm、4℃下離心洗滌；並將芽孢桿菌芽孢的濃度調節至108/mL，得到芽孢菌體混合液；
2)重鹽洗滌：向芽孢菌體混合液中加入15倍重量的重鹽洗液，混勻，在5000rpm、4℃下離心，去上清，得沉澱一；
3)酶溶液孵育：向沉澱一中加入酶消化液，懸浮沉澱，調節芽孢濃度至106/mL，37℃水浴加熱1h後，在5000rpm、4℃下離心，去上清，得沉澱二；
4)表面活性劑溶液洗滌：向沉澱二中加入表面活性劑溶液，使芽孢濃度達到106/mL，混勻後，在5000rpm、4℃下離心，去上清，得沉澱三；
5)酶抑制劑溶液洗滌：向沉澱三中加入酶抑制劑溶液，混勻後，在5000rpm、4℃下離心，去上清，得沉澱四；
6)無菌水洗滌：向沉澱四加入無菌水，震蕩混勻後，在5000rpm、4℃下離心，去上清，得沉澱五；再次加入無菌水，混勻，置於80℃水浴中滅菌20min，離心；最終得到的芽孢桿菌芽孢以無菌水混懸，保存。
其中，高鹽溶液包括有1M的KCl、0.5M的NaCl和無菌水。
其中，酶消化溶液包括有50μg/ml的溶菌酶和無菌水。
其中，表面活性劑溶液包括有0.05wt％的十二烷基硫酸鈉和無菌水。
其中，酶抑制劑溶液包括有50mM的Tris-HCl緩衝液、10mM的EDTA、2mM的苯甲基磺醯氟和無菌水。
結果分析：純化前，芽孢桿菌芽孢粗品的芽孢純度為89％；純化後，芽孢純度為97％，芽孢數量保持在108/mL，未發生損失。
實施例2
一種芽孢桿菌芽孢的純化方法，其包括以下步驟：
1)無菌水洗滌：將芽孢桿菌芽孢粗品(投放量1g)用無菌水在5000rpm、4℃下離心洗滌；並將芽孢桿菌芽孢的濃度調節至105/mL，得到芽孢菌體混合液；
2)重鹽洗滌：向芽孢菌體混合液中加入5倍重量的重鹽洗液，混勻，在5000rpm、4℃下離心，去上清，得沉澱一；
3)酶溶液孵育：向沉澱一中加入酶消化液，懸浮沉澱，調節芽孢濃度至104/mL，37℃水浴加熱1h後，在5000rpm、4℃下離心，去上清，得沉澱二；
4)表面活性劑溶液洗滌：向沉澱二中加入表面活性劑溶液，使芽孢濃度達到104/mL，混勻後，在5000rpm、4℃下離心，去上清，得沉澱三；
5)酶抑制劑溶液洗滌：向沉澱三中加入酶抑制劑溶液，混勻後，在5000rpm、4℃下離心，去上清，得沉澱四；
6)無菌水洗滌：向沉澱四加入無菌水，震蕩混勻後，在5000rpm、4℃下離心，去上清，得沉澱五；再次加入無菌水，混勻，置於80℃水浴中滅菌20min，離心；最終得到的芽孢桿菌芽孢以無菌水混懸，保存。
其中，高鹽溶液包括有1M的KCl、0.5M的NaCl和無菌水。
其中，酶消化溶液包括有50μg/ml的溶菌酶和無菌水。
其中，表面活性劑溶液包括有0.05wt％的十二烷基硫酸鈉和無菌水。
其中，酶抑制劑溶液包括有50mM的Tris-HCl緩衝液、10mM的EDTA、2mM的苯甲基磺醯氟和無菌水。
結果分析：純化前，芽孢桿菌芽孢粗品的芽孢純度為88％；純化後，芽孢純度為97％，芽孢數量保持在同一數量級，未發生損失。
實施例3
將實施例1的投放量放大100倍，其餘與實施例1相同。
結果分析：純化前，芽孢桿菌芽孢粗品的芽孢純度為89％；純化後，芽孢純度為96％，芽孢數量保持在108/mL，未發生損失。
實施例4
將實施例1的投放量放大10000倍，其餘與實施例1相同。
結果分析：純化前，芽孢桿菌芽孢粗品的芽孢純度為89％；純化後，芽孢純度為95％，芽孢數量保持在108/mL，未發生損失。
實施例5
高鹽溶液中還包括有0.1M的ZnCl2，其餘與實施例1相同。
結果分析：純化前，芽孢桿菌芽孢粗品的芽孢純度為89％；純化後，芽孢純度為98％，芽孢數量保持在108/mL，未發生損失。
實施例6
將實施例5的投放量放大10000倍，其餘與實施例5相同。
結果分析：純化前，芽孢桿菌芽孢粗品的芽孢純度為89％；純化後，芽孢純度為96.5％，芽孢數量保持在108/mL，未發生損失。
實施例7
高鹽溶液中還包括有0.1M的AlCl3，其餘與實施例5相同。
結果分析：純化前，芽孢桿菌芽孢粗品的芽孢純度為89％；純化後，芽孢純度＞99％，芽孢數量保持在108/mL，未發生損失。
實施例8
將實施例7的投放量放大10000倍，其餘與實施例7相同。
結果分析：純化前，芽孢桿菌芽孢粗品的芽孢純度為89％；純化後，芽孢純度為98％，芽孢數量保持在108/mL，未發生損失。
上述數據表明，將投放量放大後，所得結果沒有發生明顯衰減，說明該工藝穩定，具備量產基礎。
本案發現，在整個工藝環節中，重鹽洗滌的效果對最終芽孢純度和工藝穩定性的影響最大，因為它的作用是使菌體脫水，而脫水效果的好壞將直接影響後續其他工藝步驟的實施，因此，對重鹽洗液配方的改進就顯得尤為重要。實施例5說明了鋅離子的加入有利於芽孢純度在一定程度上的提升；實施例7說明了鋁離子能夠與鋅離子產生協效作用，共同提高菌體脫水的效率，從而改善最終芽孢的純度。
表1是對本工藝重複性的考察，列出了實施例4、實施例6和實施例8分別重複10次所得到的芽孢純度的浮動情況：
表1
表1表明鋅離子和鋁離子可以減小芽孢純度的波動幅度，提高該工藝的重複性，利於在大規模生產時保證產品質量。而鋅離子和鋁離子的組合使用相較於單獨添加鋅離子可以獲得更高的數據重現性。
儘管本發明的實施方案已公開如上，但其並不僅僅限於說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用於各種適合本發明的領域，對於熟悉本領域的人員而言，可容易地實現另外的修改，因此在不背離權利要求及等同範圍所限定的一般概念下，本發明並不限於特定的細節。