一種含腈水解酶基因工程菌的高密度發酵方法

2023-06-20 19:27:36

一種含腈水解酶基因工程菌的高密度發酵方法
【專利摘要】本發明公開了一種腈水解酶工程菌的高密度發酵方法，該方法採用全新的重組大腸桿菌發酵及補料培養基配方，通過採用D0-STAT偶聯分步誘導，並分階段逐步提高轉速的方法，既滿足了培養過程中隨著生物量增加對攪拌功率的需要，又有效控制了菌體的生長速率，預防了菌體生長過快引起的產酸積累，反饋抑制，培養基浪費等弊端；此外，通過採用批次補加乳糖的誘導方式，既避免了乳糖濃度過高所引起的發酵液粘度增大，致使傳氧、傳質受阻問題，又提高了誘導強度，利用本發明的高密度發酵技術，重組大腸桿菌的生物量由10.35gDCW/L提高至70gDCW/L，體積酶活從18205U/L提高至103530U/L，使發酵水平提高了4.7倍。
【專利說明】一種含腈水解酶基因工程菌的高密度發酵方法 (一）

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種產腈水解酶的重組大腸桿菌的高密度培養和目的基因的高效表 達方法。 (二）

【背景技術】
[0002] 腈水解酶能夠實現有機腈化合物的一步水解合成對應的有機羧酸。通過腈水 解酶實現氰基水解反應條件溫和，反應效率高，而且具有比較高的區域選擇性和立體選 擇性。近年來，利用腈水解酶進行氰基水解合成有機羧酸已經成為研究的熱點，大量文 獻、專利報導了腈水解酶在有機羧酸合成中的應用。更重要的是，許多對於雙腈具有區 域選擇性催化活力的腈水解酶的發現，對於阿託伐他汀側鏈關鍵手性中間體（R)-4_氰 基 _3_ 輕基丁酸（Organic Process Research&Development 20〇6, 10, 661_665)、普 瑞巴林手性中間體（3S) _3_氛基_5_甲基己酸（Journal of Molecular Catalysis 851^711^^。41，2006:75 - 80)、加巴噴丁中間體1-氰基環己基乙酸卬52005009157六1)、 L-甲基多巴等關鍵藥物中間體酶法合成工藝的建立具有巨大的指導作用。
[0003] 扁桃酸（mandelic acid, MA)又稱作苦杏仁酸，為手性分子，兩種對映異構體。光 化學純R-扁桃酸（R-M)是一種重要的精細化工中間體和手性藥物前體。廣泛應用於多種 光學活性藥物的合成，如頭孢菌素、半合成青黴素等抗生素、抗腫瘤藥物、減肥藥物、農藥及 其他藥物。此外，R-M還是重要的手性拆分劑和手性催化劑，被稱為"萬能"拆分劑，其中對 醇胺類藥物的拆分尤為突出。隨著R-M的新用途的不斷發現，其市場需求也在與日俱增。

【權利要求】
1. 一種含腈水解酶基因工程菌的高密度發酵方法，其特徵在於所述方法為：將含腈水 解酶基因的工程菌經擴大培養獲得的種子液以體積濃度2?4%的接種量接種至發酵罐， 於37°C、500rpm、通空氣比l-2vvm條件下發酵培養至發酵液溶解氧15% ±5%，開始採用 DO-STAT方式添加補料培養基，維持發酵液溶氧值在15% ±5%，調整攪拌轉速為600? 700rpm，發酵至OD6tltl達到20?40時，調整溫度至25?35°C，加入終濃度10?25g/L乳糖 進行第一次誘導；發酵至OD 6tltl達到70?110後，調整轉速至720?780rpm ;發酵至OD6tltl達 110-130,再次加入終濃度10?15g/L乳糖進行二次誘導；發酵至OD 6tltl達到115?140後， 調整轉速至780?850rpm，繼續發酵至OD6c?達到150?190後，調整轉速至900?1300rpm ; 維持發酵轉速為900?1300rpm、溫度25?35°C條件下，繼續發酵至0D_值以及比酶活在 3h內不再上升或開始下降時，停止發酵，放罐，獲得發酵液，發酵過程中維持發酵液pH值為 6. 0?7. 0 ;所述發酵罐內添加含終濃度50g/L卡那黴素的發酵培養基，所述發酵培養基組 成為：蛋白腖 10 ?20g/L，酵母粉 5 ?15g/L，NaC15 ?15g/L，甘油 5 ?20g/L，（NH4)2SO4 3 ?10g/L，KH2PO4 0· 5 ?3g/L，K2HPO4 · 3H20 I. 0 ?5g/L，MgSO4 · 7H20 0· 1 ?I. Og/L，溶劑 為水，pH值為6. 0-7. 0 ;所述補料培養基組成為：蛋白腖50-120g/L，酵母提取30?80g/L， 甘油 300 ?900g/L，檸檬酸 1 ?8g/L，硫酸銨 1 ?10g/L，K2HP04 1 ?8g/L，NaCl 1 ?IOg/ UMgSO4 1?10g/L，溶劑為水，pH值為6.0?7.0。
2. 如權利要求1所述含腈水解酶基因工程菌的高密度發酵方法，其特徵在於所述維持 發酵液溶氧值在15% ±5 %，調整攪拌轉速為700rpm，發酵至0D_達到90後，調整轉速至 750rpm ;發酵至0D_達125後，調整轉速至800rpm，繼續發酵至OD6c?達到170後，調整轉速 至 lOOOrpm。
3. 如權利要求1所述含腈水解酶基因工程菌的高密度發酵方法，其特徵在於所述發酵 液OD6c?值達30時，加入終濃度20g/L乳糖進行誘導。
4. 如權利要求1所述含腈水解酶基因工程菌的高密度發酵方法，其特徵在於所述誘導 培養至OD6c?值達120時，再次加入終濃度14g/L乳糖進行二次誘導。
5. 如權利要求1所述含腈水解酶基因工程菌的高密度發酵方法，其特徵在於所述發 酵培養基組成為：蛋白腖15g/L，酵母粉12g/L，NaCl 10g/L，甘油12g/L，（NH4)2SO4 5g/L， KH2PO4 I. 36g/L，K2HPO4 · 3H20 2. 28g/L，MgSO4 · 7H20 0· 375g/L，溶劑為水，pH 值為 6· 5。
6. 如權利要求I所述含腈水解酶基因工程菌的高密度發酵方法，其特徵在於所述補料 所用培養基組成為：蛋白腖75g/L，酵母提取50g/L，甘油500g/L，檸檬酸3g/L，硫酸銨5g/ 1^，1( 2冊04 38/1，恥(：158/1，1%504 58/1，溶劑為水，？!1值為6.5。
7. 如權利要求1所述含腈水解酶基因工程菌的高密度發酵方法，其特徵在於所述種子 液按如下方法製備：將含腈水解酶基因的工程菌接種至LB固體培養基，在37°C培養1?2 天，獲得斜面菌體；挑取斜面菌體接種至含終濃度50g/L的LB液體培養基，37°C、150rpm下 培養12?24h，得種子液。
8. 如權利要求7所述含腈水解酶基因工程菌的高密度發酵方法，其特徵在於所述含腈 水解酶基因的工程菌是以敏捷食酸菌（Acidovorax facilis)ZJB09122基因組DNA為模板， 以序列1和序列2為引物，通過PCR方法獲得含重組腈水解酶的表達質粒，然後再以含重組 腈水解酶的表達質粒為模板，以序列3和序列4為引物，通過PCR方法構建含重組腈水解酶 的工程菌； 序列 I :5' -AATGGATCCATGGTTTCGTATAACAGCAAG-3' ； 序列 2 :5' -AGGGTCGACCTACTTTGCTGGGACCGG-3' ； 序列 3 :5' -GAGCACGTTCAGCCGCTGTCCAAAT-3' ； 序列 4 :5' -CGGCTGAACGTGCTCCCAGCAGTTC-3'。
9. 如權利要求7所述含腈水解酶基因工程菌的高密度發酵方法，其特徵在於所述含腈 水解酶基因的工程菌是以糞產鹼桿菌（Alcaligenes faecalis)ZJUTB10基因組DNA為模 板，以序列5和序列6為引物，通過PCR方法獲得含重組腈水解酶的表達質粒，然後再以含 重組腈水解酶的表達質粒為模板，以序列7和序列8為引物，通過PCR方法構建含重組腈水 解酶的工程菌； 序列 5 :5' ~AATGGATCCATGCAGACAAGAAAAATCGTC~3,； 序列 6 :5' -AGGGTCGACTCAGGACGGTTCTTGCAC-3' ； 序列 7 :5' -CATGGAAGAGATCNNNTTCGCTAAGGCTATC-3' ； 序列 8 :5' -GATAGCCTTAGCGAANNNGATCTCTTCCATG-3'。
10. 如權利要求1所述含腈水解酶基因工程菌的高密度發酵方法，其特徵在於所述發 酵過程中流加體積濃度8%氨水和體積濃度10%磷酸水溶液維持發酵液pH值為6. 5。
【文檔編號】C12N9/78GK104212785SQ201410394475
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年8月12日 優先權日:2014年8月12日
【發明者】薛亞平, 鄭裕國, 柳志強, 劉兆巍, 王應鵬, 徐喆 申請人:浙江工業大學