鈍頂螺旋藻新品系選育方法

2023-06-02 12:06:06 1

專利名稱：鈍頂螺旋藻新品系選育方法
技術領域：
本發明涉及一種鈍頂螺旋藻新品系選育方法，更具體涉及一種篩選高含量γ-亞麻酸鈍頂螺旋藻新品系的選育方法。
目前，月見草種子是γ-亞麻酸的主要資源，茶藨子、琉璃苣、被孢黴素和真菌也含有γ-亞麻酸。大量培養真菌來生產γ-亞麻酸困難大，高等植物的γ-亞麻酸含量僅佔總脂肪酸含量的8-12％，且伴隨十八碳四烯酸產生，分離它費用昂貴，生產周期長，產量低，不能滿足γ-亞麻酸的需求。
近二十年來國內外螺旋藻生物技術產業化飛速發展，以高蛋白著稱的螺旋藻γ-亞麻酸含量佔總脂肪酸含量的25％左右，所以螺旋藻成為γ-亞麻酸的新資源具有很大潛力。目前國外已成功地利用一些培養條件來提高真核藻類不飽和脂肪酸的含量，但此法對螺旋藻不起作用，因為這些培養條件同時使其生長受到了抑制，而γ-亞麻酸的含量與生物量緊密相關。Cohen等人發現除草劑SAN9785能抑制螺旋藻的生長，同時也使得螺旋藻的γ-亞麻酸和亞油酸含量降低，硬脂酸和油酸含量升高，表明SAN9785對螺旋藻脂肪酸合成中的Δ6去飽和起抑制作用，[Cohen，Z.，Norman，H.A.and Heimer，Y.M.，1993.Potential use ofsubstituted pyridazinones for selectingpolyunsaturatedfatty acid overproducing cell lines of algae，phytochem；32(2)，PP259-264]Cohen等人用逐步增加培養液中SAN9785濃度(0.2mM-0.4mM)來馴化培養鈍頂螺旋藻，提高其抗SAN9785能力，從中篩選出γ-亞麻酸含量較高的螺旋藻SRS—1h品系(γ-亞麻酸含量為1.43％佔乾重)，此方法主要是通過外界因子SAN9785脅迫螺旋藻品系而提高其抗性，因此，篩選機率較小，所得新品系穩定性值得考慮，而且工作量大，周期長，至少需幾個月，另外，由於某些原因此品系未用於生產上，僅停留在實驗室水平(Cohen，z.，Didi，s.and Heimer，Y.M.，1992，Overproduction of γ-Linolenic and EicodsapentaenoicAcids by algae，Plant Physiol，98569-572)。
本發明的目的是提供了一種鈍頂螺旋藻新品系選育方法，從而提高了篩選的機率，縮短了篩選時間，解決了品系選育中篩選機率較小和穩定性的問題。
為實現上述的目的，本發明採用以下技術方案用80-120μg/ml NTG對鈍頂螺旋藻出發品系進行誘變，誘變後的懸浮液在1800-2200Lux，25-29℃連續光照下靜置培養7-10天，然後加入0.3-0.5mMSAN9785進行篩選，篩選出的抗SAN9785突變株在基本培養平板上劃線純化，最後擴大培養所得的γ-亞麻酸含量較高的螺旋藻SP-HG8新品系，此品系的各項特徵列表如下表1
表2 從表1、表2中可看出，突變品系SP-HG8的γ-亞麻酸含量是出發品系SP(NS)-90020的2.2倍，而且SP-HG8品系的總脂肪酸，蛋白質和胺基酸含量與出發品系相比分別升高了109、28％、9、26％和3、05％，SP-HG8的胺基酸組成合理，其中蘇氨酸和丙氨酸含量與出發品系相比分別升高了171.43％、162.12％，而且SP-HG8的藻絲體較長，上浮率和過濾效率均較好，生長速率也比出發品系快，生長代時較短。
實施例採用螺旋藻SP(NS)-90020出發品系(γ-亞麻酸含量為0.72％佔乾重)進行無菌培養，取對數期的藻液離心收集，用磷酸緩衝液(PH＝7.0，1/15M)洗滌，然後懸於磷酸緩衝液中，NTG過濾滅菌後以50-200μg/ml的濃度加入藻液中，黑暗中36-38℃水浴放置30-60分鐘，誘變後藻液離心，並用無菌的磷酸緩衝液(PH＝7.0)洗滌；再將誘變洗滌後的懸浮液在1800-2200Lux，25-29℃連續光照下靜置培養7-10天，使細胞內突變基因分離、表達，然後分別配製0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mMSAN9785的實驗培養基，加入一定體積的出發品系藻液和誘變表達後藻液培養，選出對照生長不好而抗性突變株生長好的適當濃度作為初篩濃度，取能在篩選濃度中生長的抗性突變株，再次在含篩選濃度的SAN9785的基本培養基中培養一段時間，再用毛細管分離法挑選在篩選濃度SAN9785的實驗培養基中生長良好的單根絲體放入試管中靜止培養，20-30天藻落長出後，再用毛細管分離法進行反覆分離，直至絲體純化為止，最後放在篩選濃度SAN9785的實驗培養基中培養，測定生長曲線，生長速率高的為所需抗SAN9785的突變品系，復篩後所得的品系在基本培養平板上劃線，挑起小段單絲體置於基本培養基中培養7-10天，測定生長曲線，生長速率高的為所需抗SAN9785的突變品系，對所得突變品系進行擴大培養，測定其脂肪酸含量，其中γ-亞麻酸含量高的品係為所需要的突變品系。
本發明的優點是先用NTG誘變，再用SAN9785篩選，方法易行，提高了篩選機率，縮短了時間，所得品系穩定可靠，SP-HG8的γ-亞麻酸含量高，比出發品系高出119.72％，比Cohen所得的SRS-1H品系高出9.86％，SP-HG8的總脂肪酸、蛋白質和胺基酸含量高，其中胺基酸組成也十分合理，SP-HG8的藻絲體長，上浮率和過濾效率均較好，生長速率快，生長代時短，成體低，適用工廠化生產。
權利要求
1.一種鈍頂螺旋藻新品系選育方法，其特徵在於對鈍頂螺旋藻出發品系用80-120μg/mlNTG進行誘變，誘變後的懸浮液在1800-2200Lux，25-29℃連續光照下靜置培養7-10天，加入0.3-0.5mMSAN9785進行篩選，篩選出的抗SAN9785突變株在基本培養平板上劃線純化，擴大培養。
2.根據權利要求1所述的一種鈍頂螺旋藻新品系選育方法，其特徵在於NTG過濾滅菌後以50-200μg/ml的濃度加入藻液中，黑暗中36-38℃水浴放置30-60分鐘。
3.根據權利要求1所述的一種鈍頂螺旋藻新品系選育方法，其特徵在於用毛細管分離，挑起小段單絲體置於基本培養基中培養7-10天。
全文摘要
本發明公開了一種鈍頂螺旋藻新品系選育方法，對鈍頂螺旋藻出發品系用80-120μg/mlNTG進行誘變，誘變後的懸浮液在1800-2200Lux，25-29℃連續光照下靜置培養7-10天，加入0.3-0.5mMSAN9785進行篩選，篩選出的抗SAN9785突變株在基本培養平板上劃線純化，擴大培養。本發明方法易行，提高了篩選機率，縮短時間，新品系穩定可靠，γ-亞麻酸含量高，適用工廠化生產。
文檔編號A01H13/00GK1144037SQ9510937
公開日1997年3月5日 申請日期1995年9月1日 優先權日1995年9月1日
發明者殷春濤, 胡鴻鈞, 龔小敏 申請人:中國科學院武漢植物研究所