一種提高大腸桿菌耐熱性的分子調控方法

2023-06-02 13:28:51 2

一種提高大腸桿菌耐熱性的分子調控方法
【專利摘要】針對現代生物醫藥與輕工業食品產業體系中，微生物控溫發酵生產過程高能耗的問題。本發明提供了一種提高大腸桿菌耐熱性的分子調控方法，屬於生物化工領域。以嗜熱菌和耐熱菌熱激蛋白、泛素、熱誘導轉錄因子基因作為核心功能元件，不同強度啟動子作為調控元件，通過單功能、簇狀、多功能串聯3種方式組裝耐熱元器件，並實現與底盤宿主大腸桿菌的集成。通過梯度升溫和恆定高溫培養發酵表徵元器件的耐熱性，根據工程菌不同耐熱溫度範圍，將耐熱元件劃分為強、中、弱三類，實現大腸桿菌在分子水平上不同耐熱程度的調控。為工業發酵生產生物基產品的高效、低能耗過程提供了新方法。
【專利說明】一種提高大腸桿菌耐熱性的分子調控方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及大腸桿菌耐熱元器件的構建方法及其與底盤宿主的集成，實現分子水平上調控大腸桿菌耐熱性，屬於生物化工領域。
【背景技術】
[0002]微生物耐熱性是決定發酵過程能量消耗和產物合成效率的重要因素。在利用微生物發酵生產生物製品的過程中，細胞新陳代謝釋放出大量的熱，發酵體系逐漸升溫，無法自行降到反應所需的最適溫度，所以需消耗大量冷卻水控溫，導致動力費用增加、發酵過程高能耗的問題。但與之矛盾的是，胞內大多數酶最適反應溫度都高於最適生長溫度，從反應熱力學角度分析，提高溫度可以有效地活化反應過程，加速代謝傳質，提高細胞合成效率。所以提高發酵菌株耐熱性，擴寬最適生長溫度的範圍將很好的解決這一矛盾，同時能夠大幅度降低成本，提高生產效率。
[0003]大腸桿菌的基因操作簡單，易於培養，生產成本低，是工業生物技術應用最廣泛的工業生產菌株之一。因此，提高大腸桿菌的耐熱性是獲得低成本生物製品的有效途徑。目前研究中，主要通過高溫篩選或馴化的方式提高大腸桿菌耐熱性，但這種方法只能提高最適生長溫度，無法擴寬最適生長溫度範圍，不能滿足工業發酵逐漸升溫的需求。對於分子層面上的研究，目前主要通過調控大腸桿菌自身一些轉錄因子或蛋白表達來提高耐熱性，此方法受限於大腸桿菌本身的耐熱機制，效果並不明顯。而通過引入外源耐熱機制分子水平上改造大腸桿菌的耐熱性雖已有報導，但研究不系統，應用於工業梯度升溫發酵還未見報導。
[0004]嗜熱微生物大部分屬古菌域，一般生活在地球上的極熱環境中，代表了生命溫度的極限，部分耐熱的機理已經得到合理的闡述，比如特殊細胞膜組成成分、更緊密的蛋白質空間結構、熱誘導轉錄因子、熱激蛋白(HSP)等。其中產生大量熱激蛋白是一種重要的分子調控手段，其不僅在熱脅迫下能夠有效的保護細胞，對於有機溶劑、酸性環境等脅迫也能發揮其生理生化功能。目前，將 熱保護機制中的關鍵的基因開發成具有耐熱功能的分子元器件來改造大腸桿菌的耐熱性，並且應用於工業生產的發酵過程還未見有文獻報導。
[0005]基於近年來合成生物學快速發展，發掘了不同強度的耐熱元器件並進行人工設計及優化，對大腸桿菌進行分子水平的調控，提高了其耐熱性。應用於微生物發酵生產過程，將大幅度提高生產強度，降低成本。

【發明內容】

[0006]本發明的目的是通過提高大腸桿菌耐熱性，解決其在工業發酵過程中由於控制常溫發酵導致生產過程高能耗的問題，降低生產成本。
[0007]為實現上述目的，本發明的技術方案提供了一種構建耐熱元器件及耐熱大腸桿菌的方法，實現從分子水平上調控大腸桿菌的耐熱性。從嗜熱菌和耐熱菌中通過克隆或人工合成得到一系列對細胞具有熱保護功能的基因作為功能元件，如熱激蛋白(HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、smHSP)、泛素和熱誘導轉錄因子基因等，同時以大腸桿菌不同強度啟動子和終止子作為調控元件，通過以下3種不同的組裝方式構建耐熱元器件。(I)以單個功能元件和調控元件組裝成耐熱元器件:啟動子-功能元件-終止子。(2)針對耐熱功能互作的功能元件共組裝成簇狀耐熱元器件:啟動子-功能元件1-功能元件2…功能元件η-終止子(n ^ 2)。(3)針對具有不同熱保護功能的耐熱功能元件組裝成串聯型耐熱元器件:啟動子1-功能元件1-啟動子2-功能元件2...啟動子η-功能元件η-終止子(n ^ 2)。將構建的所有耐熱元器件連接載體後，轉化大腸桿菌，實現耐熱元器件與底盤宿主大腸桿菌的集成，以拓寬大腸桿菌的最適生長溫度範圍，提高其耐熱性。通過梯度升溫發酵及恆定高溫發酵表徵工程菌耐熱性，根據耐熱溫度範圍，將所有耐熱元器件劃分為強、中、弱三類，可實現大腸桿菌不同耐熱程度的分子調控。
[0008]本發明的提高大腸桿菌耐熱性的分子調控方法，具有以下優點:
[0009]1、本發明構建的耐熱元器件實現了大腸桿菌不同程度耐熱性的分子調控，滿足了不同發酵生產要求。
[0010]2、本發明構建的耐熱大腸桿菌工程菌，簡化了發酵工藝，降低了生產成本，達到節能減排的目的。
【具體實施方式】
[0011]下面結合實施例，對本發明的【具體實施方式】進一步詳細描述。以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。
[0012]實施例1:單功能元件耐熱元器件組裝
[0013]通過NCB1、HSPIA等資料庫查閱已完成測序的嗜熱和耐熱微生物以及相關具有熱保護功能基因，選取熱激蛋白、泛素和熱誘導轉錄因子基因作為功能元件。以騰衝嗜熱菌HSP20家族基因IbpA為例，`與啟動子和終止子進行兩次OE-PCR連接組裝耐熱元器件:啟動子-1bpA-終止子。啟動子與終止子兩端分別設置Bgl II和Xho I酶切位點作為所有耐熱元器件的酶切位點，耐熱元器件與pET-28a(+)載體雙酶切後進行連接，轉入大腸桿菌，實現與底盤宿主大腸桿菌的集成。
[0014]實施例2:簇狀耐熱元器件組裝
[0015]NCB1、HSPIA等資料庫獲得的功能元件中，有部分功能元件通過互相協作行駛正常的生理生化功能。以熱激蛋白DnaK/DnaJ系統為例，DnaJ攜帶錯誤摺疊的蛋白質結合到DnaK單體的ATP位點，幫助蛋白質正確摺疊。通過OE-PCR和酶切連接的方式連接構建耐熱元器件:啟動子-DnaK-DnaJ-終止子。啟動子與終止子兩端分別設置Bgl II和Xho I酶切位點，耐熱元器件與pET-28a(+)載體雙酶切後進行連接，轉入大腸桿菌獲得耐熱的工程菌。其他具有互作功能的元件採用同樣的方式構建耐熱元器件。
[0016]實施例3:多功能串聯型耐熱元器件組裝
[0017]不同的功能元件對細胞具有不同的保護作用，以熱誘導轉錄因子和熱激蛋白為例，熱誘導轉錄因子能在高溫脅迫下轉錄翻譯，激活細胞內的特殊熱保護機制，平衡高溫環境下的代謝平衡。熱激蛋白最基本的功能是與高溫環境下的變性的蛋白質結合，修復錯誤摺疊的蛋白並維持空間構象和功能，防止其受到環境的損害。通過OE-PCR和酶切連接的方式連接構建耐熱元器件:啟動子1-熱誘導轉錄因子-啟動子2-熱激蛋白-終止子。啟動子I與終止子兩端分別設置Bgl II和Xho I酶切位點，與載體雙酶切後進行連接，轉入大腸桿菌獲得耐熱的工程菌。其他功能的元件採用同樣的方式構建耐熱元器件。
[0018]實施例4:耐熱元器件的驗證及分類
[0019]通過工程菌高溫發酵表徵所有元器件的耐熱性。37°C培養工程菌菌液OD6tltl達到
1.0左右後，通過兩種方式進行高溫培養發酵:第一種方法以3°C為一個溫度梯度，逐步提高培養溫度至40°C、43°C、46°C，每個溫度梯度培養3h ;第二種方法將OD6tltl達到1.0左右的工程菌菌液直接放入40°C、43°C、46°C進行恆定高溫培養。以0D_值的變化來表徵耐熱性，確定耐熱範圍，並將耐熱元器件分為?強(37V -46°C)、中(37°C _43°C )、弱(37°C _40°C )三類。比如，元器件「啟動子-1bpA-終止子」的耐熱範圍為37°C _46°C，劃分為「強」耐熱元器件類型；元器件「啟動子-ThiF-終止子」的耐熱範圍為37°C _43°C，劃分為「中」耐熱元器件類型。
【權利要求】
1.一種提高大腸桿菌耐熱性的分子調控方法，其特徵在於，從嗜熱菌和耐熱菌中通過克隆或人工合成得到對細胞具有熱保護功能的基因作為功能元件，以不同方式構建耐熱元器件，提高大腸桿菌耐熱性，將耐熱元器件劃分為強、中、弱三類，實現大腸桿菌不同耐熱程度的分子調控。
2.如權利要求1所述的實現分子調控的耐熱元器件的構建，通過3種方式構建耐熱元器件:(I)以單個功能元件和調控元件組裝成耐熱元器件；(2)針對耐熱功能互作的功能元件共組裝成簇狀耐熱元器件；(3)針對具有不同熱保護功能的耐熱功能元件組裝成串聯型耐熱元器件。
3.如權利要求2所述的耐熱元器件及其 構建方法在提高大腸桿菌耐熱性方面的應用。
【文檔編號】C12N15/70GK103773791SQ201410020497
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月16日 優先權日:2014年1月16日
【發明者】李春, 孫翔英, 劉月芹, 孫歡, 賈海洋, 周曉宏 申請人:北京理工大學