獸藥青黴素g降解物苄青黴噻唑酸人工抗原及其特異性抗體的製作方法

2023-06-02 14:31:01 2

專利名稱：獸藥青黴素g降解物苄青黴噻唑酸人工抗原及其特異性抗體的製作方法
技術領域：
本發明屬於小分子化合物(分子量小於1000道爾頓)免疫化學和殘留分析技術 領域；涉及有機合成，免疫化學，生物化學及物化測試技術等；特別涉及具有涉及具有氫化 噻唑環與β-內醯胺環併合的雜環分子結構的青黴素類獸藥青黴素G降解物苄青黴噻唑酸 小分子化合物人工半抗原、特異性抗原的設計合成。
背景技術：
青黴素G(亦稱苄青黴素)是青黴素類抗生素的一種，青黴素類抗生素是進入臨 床應用最早的一類抗生素，也是我國生產量最大、使用量最多的抗生素。青黴素類抗生素 已經成為治療奶牛和其他可食性動物疾病最常用的藥物，但由於用藥的不規範和奶樣收集 的不當，致使動物源性食品中青黴素類藥物殘留現象嚴重。青黴素類藥物在體內殘留會產 生嚴重的過敏反應，且過敏反應率高居各類藥物之首。由於青黴素易在內醯胺酶作用 下降解為青黴噻唑酸，使青黴素失去抗菌活性，這使現有的檢測方法無法檢測出青黴素殘 留，更加助長了牛奶生產中內醯胺類抗生素的濫用，加速了耐藥菌的傳播，嚴重威脅了 中國奶業的長期發展。為此，對青黴素殘留的限制也因此越來越嚴格，並且對分析測定對 象、種類、數量、範圍、指標等諸方面，都提出新的要求和更高的標準。中國農業部發布的動 物性食品中獸藥最高殘留限量，對青黴素G的規定肌肉≤50μ g/kg，脂肪≤50μ g/kg，肝 ≤ 50μ g/kg，腎≤50μ g/kg，奶≤4μ g/kg，雖然並沒有對苄青黴噻唑酸作出相應規定，但 其造成的危害不容忽視。分子量小於1000道爾頓的小分子有毒化學品，如農藥、獸藥及其 代謝產物，其傳統的殘留分析主要是依靠氣相色譜、液相色譜或色譜-質譜聯用等分析手 段。這些理化分析方法，繁瑣複雜、成本較高、分析速度慢，難以滿足實際分析的需要，因此 迫切需要開發簡便、快速、靈敏的分析技術。但是與大分子不同，小分子化合物免疫分析有自身特點(1)小分子化合物〔MW ≤ lOOOdolton〕一般不具有免疫原性，不能直接免疫動物產 生特異性抗體、必須合成突出分子立體結構特異性部位的半抗原，並與大分子載體連接構 成接合物，才能免疫動物產生針對這一目標小分子化合物的特異性抗體。這種半抗原與大 分子載體的結合物稱為人工抗原。人工抗原的製備不是任意的，包括結合位點、結合方式、 載體種類、以及半抗原與目標分析物任何結構上的差異如大小、形狀、成份、構型、構象、極 性、電子云密度等等在內的諸因素，都可能極大地影響著相應抗體的性質，因此它們是決定 產生其特異性抗體和建立免疫分析方法的關鍵。(2)雖然小分子化合物不具有免疫原性，但具有反應原性，即具有與相應抗體發生 免疫學反應的能力，並可體外定量進行，遵循質量作用定律。(3)基於抗原抗體免疫反應檢測小分子化臺物的分析技術，目前多採用酶聯免疫 分析(ELISA)。利用酶促反應顯示抗原抗體的定量結合，操作簡單，又具有相當的靈敏度，近 年來發展很快。80年代以來發展起來的獸藥ELISA和簡易酶免疫EIA技術，使獸藥殘留分析在方法上獲得更大的生命力；對使用快速分析樣本基質過於複雜，用普通理化方法難以 分析的獸藥殘留，具有相當的應用價值。免疫分析技術被引入獸藥殘留分折領域，成為一種最有發展和應用潛力的定量分 析技術之一，受到廣泛的重視。該技術研究的關鍵是半抗原的分子設計、合成和人工全抗原 及抗體的製備。因此，目標分析物分子免疫學特性，以及如何通過化學或生化技術突出和利 用這些特性，是該領域重要的研究內容。這一技術目前已成為微量分析研究的一個嶄新領 域，可與傳統分析方法並列作為一項新的分析途徑。小分子化合物(分子量小於1000道爾頓)，依靠免疫學、免疫化學基本原理和生物 技術手段。該技術研究的關鍵是半抗原的分子設計、合成和人工全抗原及抗體的製備。因 此，目標分析物分子免疫學特性，以及如何通過化學或生化技術突出和利用這些特性，是該 領域重要的研究內容。這一技術目前已成為微量分析研究的一個嶄新領域，可與傳統分析 方法並列作為一項新的分析途徑。目前青黴素G及其降解物苄青黴噻唑酸人工抗原尚未見 報導。

發明內容
需要解決的科學問題針對上述情況，當前急需一種簡易快速有效地檢測青黴素 G及其降解物苄青黴噻唑酸的方法。本發明的目的是通過設計合成具有6-氨基己酸分子結 構和β-內醯胺環分子結構的青黴素類獸藥青黴素G及其降解物苄青黴噻唑酸的半抗原和 人工抗原，製備針對青黴素G及其降解物苄青黴噻唑酸的特異性抗體；獨特之處在於突出 了這類獸藥分子特異性抗原決定簇，又克服了化學合成的困難，免疫動物誘導產生親合性 很高的特異性抗體。技術方案本發明設計、合成了小分子目標分析物的半抗原，並與載體蛋白質偶聯，製備有效 的人工抗原，免疫動物製備針對小分子分析物的特異性抗體。其選擇性決定於免疫學反應 的特異性，可為建立快速準確的青黴素G及其降解物苄青黴噻唑酸殘留定量分析方法奠定 基礎。該技術研究的關鍵是半抗原的分子設計、合成和人工全抗原的製備。苄青黴噻唑酸結構如下圖所示
權利要求
1.獸藥青黴素G降解物苄青黴噻唑酸人工抗原和抗體其特徵在於使用分子式為
2.權利要求1所述的獸藥青黴素G降解物苄青黴噻唑酸半抗原的製備方法，其特徵 在於是用下述步驟製得取OS，5R，6R) -3，3- 二甲基-6- (2-苯乙醯氨基)_7_氧代-4-硫 雜-1-氮雜雙環[3，2，0]庚烷-2-甲酸鉀鹽1.500g，WA4.0ml IM鹽酸，得到半抗原 (2S，5R，6 -3，3-二甲基-6-(2-苯乙醯氨基)-7-氧代-4-硫雜-1-氮雜雙環[3,2,0]庚 烷-2-甲酸白色固體，雙蒸水洗滌並乾燥即可得到半抗原；
3.權利要求1所述的獸藥青黴素G降解物苄青黴噻唑酸人工抗原的製備方法，其特徵 在於是用下述步驟製得取權利要求2所得白色固體0. 5000g溶於2ml四氫呋喃中，加入 0. 1500gN-羥基琥珀醯亞胺和0. 5000gN, N-二環己基碳二亞胺，在22_25°C下，攪拌反應過 夜，然後放於4°C冰箱內18小時，離心除去沉澱，將上層活化酯液加入到pH 7. 0溶有IOmg 鑰孔血藍蛋白的anlPBS溶液中，經攪拌後於4°C下反應5小時，將反應液裝入透析袋，4°C 下、在PH 7. 4的PBS中透析三天即可得到人工抗原；
4.權利要求1所述的獸藥青黴素G降解物苄青黴噻唑酸酶標抗原的製備方法，其特徵 在於是用下述步驟製得取權利要求2所合成的半抗原1. 9mg溶於2ml 二甲基甲醯胺配成 溶液A，0. 54mg辣根過氧化物酶溶於aiil pH 7. 4的0. 2mol/L磷酸緩衝液中配成溶液B，然 後在冰浴下將溶液A緩慢的加入溶液B中，經攪拌後在4°C下反應過夜，最後將反應液置入 透析袋中，在4°C下用pH7.4的0. 2mol/L磷酸緩衝液透析三天即可得到酶標抗原，用於顯色 反應；
5.權利要求1所述的獸藥青黴素G降解物苄青黴噻唑酸抗體的製備方法，其特徵在於 是用下述步驟製得免疫動物選用雌性紐西蘭大白兔，免疫方法採用皮下和肌肉注射法，初免後進行四次 加強免疫，加強免疫分別於初次免疫後2周、4周和6周後免疫三次，此後間隔一個月，進行 第五次免疫，9天後由兔子的耳緣靜脈取血，進行效價檢測，具體做法是初次免疫取Img按照權利要求3所述方法合成的人工抗原溶於0. 9%的NaCl溶液和 弗氏完全佐劑等體積所配製的溶液中，進行動物免疫；加強免疫用0. 5mg上述人工抗原溶於0. 9%的NaCl溶液和弗氏不完全佐劑等體積所 配製的溶液，進行動物免疫；抗體純化定時監測動物抗體效價，當抗體對一定的包被抗原達到適宜效價時，採集血 液，並離心獲得抗血清，使用G-kpharose蛋白親和層析柱對抗血清進行純化，獲得抗獸藥 青黴素G降解物苄青黴噻唑酸的特異性抗體。
全文摘要
獸藥青黴素G降解物苄青黴噻唑酸人工抗原和抗體及其製備方法，涉及具有(2S，5R，6R)-3，3-二甲基-6-(2-苯乙醯氨基)-7-氧代-4-硫雜-1-氮雜雙環[3，2，0]庚烷-2-甲酸結構的苄青黴噻唑酸半抗原，人工抗原和抗體的製備及其在建立免疫分析方面的應用。本發明克服了傳統的理化分析方法繁瑣複雜，成本較高，分析速度較慢的問題，提供了簡潔，快速，靈敏，準確的免疫分析技術。它以(2S，5R，6R)-3，3-二甲基-6-(2-苯乙醯氨基)-7-氧代-4-硫雜-1-氮雜雙環[3，2，0]庚烷-2-甲酸為半抗原，分別與KLH和HRP連接合成人工抗原和酶標抗原。人工抗原再經動物免疫，取血，分出抗血清，純化制的抗體。該抗體穩定，具有良好的特異性和靈敏度，且合成方法簡單，可用於獸藥青黴素G降解物苄青黴噻唑酸的快速免疫檢測，具有良好的應用前景。
文檔編號C07K1/113GK102040661SQ20091007086
公開日2011年5月4日 申請日期2009年10月19日 優先權日2009年10月19日
發明者張燕, 江月明, 王俊平, 王碩 申請人:天津科技大學