太空環境下的高效重組人幹擾素α1b工程菌的製作方法
2023-06-02 13:58:46 2
專利名稱：太空環境下的高效重組人幹擾素α1b工程菌的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及生產重組人幹擾素a Ib的工程菌，其製備的產物可廣泛應用於臨床醫療。
背景技術：
生物工程菌菌種傳統的誘變處理方法主要包括以紫外線、X射線、Y射線、雷射等作為誘變介質的物理誘變方法和以鹼基類似物、烷化劑甲基磺酸乙酸等為誘變介質的化學誘變方法，及以噬菌體、轉座子為誘變介質的生物誘變方法。通過各種誘變手段改變菌體的遺傳性狀後，如何從數量龐大的菌體族群中篩選到特異性目標菌種，是育種上最重要也是最耗時費力的工作，篩選在一定程度上是決定菌種選育效率的關鍵步驟。在菌種選育中常用的隨機篩選法是逐個檢查、測定經誘變處理後的存活菌株的目標產物產量或其他性狀。為加快篩選速度而採用諸如平皿快速檢測法、形態變異的利用、計算機技術的應用等多種·方法，但是這些方法工作量大、周期長、隨機性大、成本高。隨著航天技術的發展，空間誘變為菌種改良提供了新的手段，對於篩選得到更多高效菌種具有獨特的優勢。空間生物製藥是當代空間技術發展的產物。其基本原理是利用空間環境使相對呈漂浮伸展狀態的生物染色體受到外界因素的衝擊，引起鹼基的缺失、置換或插入(如引起生物DNA大分子斷裂，使雙螺旋中的氫鍵斷裂，或斷裂後再交叉聯接，或促使鹼基降解)，從而改變基因內部原有的鹼基及排列順序，引起表型發生改變，產生新的遺傳變異，返回後再經地面篩選，培養出高產、優質的生物新品種、新品系和效價高、品質優的生物製劑種子。重組人幹擾素是一種常用的藥物，在臨床上應用十分廣泛。幹擾素具有廣譜抗病毒、抗腫瘤、抑制細胞增殖以及提高免疫功能等作用。它與細胞表面受體結合，誘導細胞產生多種抗病毒蛋白，從而抑制病毒在細胞內的複製；可通過調節免疫功能增強巨噬細胞、淋巴細胞對靶細胞的特異細胞毒作用，有效地遏制病毒侵襲和感染的發生；增強自然殺傷細胞活性，抑制腫瘤細胞生長，清除早期惡變細胞等。因此，重組人幹擾素可用於治療某些病毒性疾病，如急慢性病毒性肝炎、帶狀皰疹、尖銳溼疣等。也可以用於治療某些腫瘤，如毛細胞性白血病、惡性黑色素瘤、腎細胞癌、喉乳頭狀瘤、卵巢癌等。目前市場上的重組人幹擾素價格還相對比較貴，必然增加患者就醫的負擔，如果提高生物工程菌的產能，其價格也會相應便宜，對於增強企業的競爭力和惠及患者，有著重要的現實意義。
發明內容
本發明的目的是提供一種高效重組人幹擾素a Ib工程菌，提高了生物工程菌的產能，降低其生產成本。本發明提供的高效重組人幹擾素a Ib生物工程菌菌株，其保藏號為CGMCCNO. 6632。所述的一種高效重組人幹擾素a Ib工程菌菌株，電泳結果顯示經過30°C誘導的該菌株目的蛋白的純度與對照菌株的比較SDS非還原條件下為1. 28倍，SDS還原條件下為1. 37倍，SDS+Urea非還原條件為1. 35倍，SDS+Urea還原條件為1. 66倍。
具體實施例方式下述實施實例中所用的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施實例中所用的材料、試劑，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。重組人幹擾素a Ib菌株經過神州八號搭載，2011年11月I日從地球出發，11月17日返回地面，共計空間飛行398小時，1100萬公裡。對返回地面的空間誘導後的重組人幹擾素a Ib菌株進行篩選，獲得6株太空環境下較高表達的重組人幹擾素a Ib生物工程菌菌株，經實驗驗證最終確定有5株正向突變菌種的產生。具體實施實例一重組人幹擾素a Ib空間環境菌種的分離空間環境育種流程平板分離一抗性平板初篩一試管復篩一誘導分析一第一輪表達篩選一第二輪表達篩選一獲取高產菌株(I).抗性平板初篩結果取250 μ I IFNa lb_2LlA菌液接種於裝有750 μ I生理鹽水的試管中，混勻；再取100 μ I稀釋後的菌液接種於裝有900 μ I生理鹽水的試管中，依次稀釋至第5管，取100 μ I塗布於LB平板，37°C靜止培養12-20hr。挑取300個單克隆，分別接種六塊LB-Amp和LB平板。同時對應在無抗性培養基上對照接種。37°C靜止培養5-7h。結果顯示在抗性和非抗性平板均生長的陽性克隆為221株，佔73. 7% ;僅在LB平板生長的陰性克隆數(抗性丟失)79 株，佔 26. 3%。(2).第一輪電泳結果分析對抗性平板初篩結果陽性克隆中編號在前的144株(克隆號I至194)進行試管復篩和誘導表達後，再進行電泳檢測和軟體分析。根據IFNa Ib理論分子量19. 4KD，以及以往經驗，按照Ml或者M2的分子量進行計算，以軟體分析IFNa Ib條帶的灰度及純度，其中以灰度代表目的蛋白的總量，總灰度代表菌體總蛋白的量，純度代表目的蛋白佔菌體總蛋白的比例。選取每次電泳15個克隆中灰度或純度最高的克隆用於下一輪檢測，灰度及純度最大值與次大值所對應的克隆號如表1，其中37、64、93是重複出現，合併後為26個克隆。電泳圖見
圖1。表I第一輪電泳灰度及純度最大值與次大值所對應的克隆號
權利要求
1.一種太空環境下的高效重組人幹擾素a Ib工程菌菌株，其保藏號為CGMCCNO. 6632。(填寫正確的保藏號)
2.根據權利要求1所述的一種高效重組人幹擾素aIb工程菌菌株，其特徵在於該菌株在經過30°C誘導後目的蛋白的純度與對照菌株的比較為SDS非還原條件下為1. 28倍，SDS還原條件下為1. 37倍，SDS+Urea非還原條件為1. 35倍，SDS+Urea還原條件為1. 66倍。
全文摘要
本發明涉及太空環境中的一種高效重組人幹擾素α1b工程菌菌株。對重組人幹擾素α1b空間搭載菌種進行平板分離、抗性平板初篩和試管復篩，然後進行誘導表達，再通過兩輪SDS-PAGE分析獲取高產菌株。將獲得的太空環境下較高表達的重組人幹擾素α1b基因工程菌菌株和原始菌株分別在30℃和37℃溫度下誘導表達並進行比較，確定了正向突變菌株(克隆191)的產生。此種高效重組人幹擾素α1b工程菌菌株的成功製備有利於幹擾素的工業生產，造福人類健康。
文檔編號C12N1/21GK102994438SQ20121044464
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月9日 優先權日2012年11月9日
發明者劉長庭, 劉金毅, 王雅娟, 徐晨, 方向群, 王俊鋒, 劉桂東, 郭英華, 常德, 陸小冬 申請人:中國人民解放軍總醫院, 北京三元基因工程有限公司