一種kras第2號外顯子基因突變檢測試劑盒的製作方法
2023-05-29 14:50:56 2
專利名稱：一種kras第2號外顯子基因突變檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本實用新型涉及ー種檢測試劑盒，尤其是涉及ー種KRAS第2號外顯子基因突變檢測試劑盒。
背景技術：
KRAS蛋白處於EGFR信號通路的下遊。在正常生理情況下，EGFR信號通路被活化後，KRAS蛋白短暫激活，其後迅速失活，KRAS激活/失活效應是受控的。而當KRAS基因突變時，會導致EGRF信號通路持續激活，加速腫瘤細胞増殖。KRAS基因突變96%是發生在第2號外顯子的12、13號密碼子。20%非小細胞肺癌(NSCLC)、30-35%大腸癌患者中存在KRAS基因突變。吉非替尼、厄洛替尼、西妥昔單抗是和帕尼單抗是目前臨床應用較廣的EGFR靶向藥物。研究表明，KRAS第12和13密碼子的突變與西妥昔單抗、帕尼單抗及EGFR-TKIs的 耐藥有夫。目前KRAS基因檢測已被歐美地區列為大腸癌患者內科治療前必做的常規檢查。大量臨床研究表明，靶向藥物(如愛必妥和帕尼單抗)對於未發生KRAS基因突變的患者有效率可達到60%，而對已發生KRAS基因突變的患者則完全無效。KRAS基因檢測是目前醫生了解大腸癌患者癌基因狀況最直接、最有效的方法。通過檢測KRAS基因有沒有突變，可以篩選出抗EGFR(表皮生長因子受體)靶向藥物治療有效的大腸癌患者，實現腫瘤病人的個體化治療，從而延長患者生存期。對於沒有突變的患者，則能減少不必要的治療費用和毒副作用。目前臨床檢測KRAS基因突變的檢測試劑原料需多方配備，實驗過程分步進行，耗時較長，容易汙染，準確性不高，所以探索一種檢測KRAS基因突變快速可靠的方法已經成為臨床實驗研究的熱點問題。
實用新型內容為了解決上述技術問題，本實用新型提供ー種KRAS基因第2號外顯子突變檢測試劑盒，它包括盒體I、盒蓋2，盒體I內設置擴增盒3和純化盒4 ;擴增盒3內設置有PCR管5、裝KRAS2-1弓丨物的試劑瓶6、裝KRAS2-2弓丨物的試劑瓶7、裝酶混合物的試劑管8、去離子水瓶9 ;純化盒4內設置有醋酸鈉溶液瓶10、電泳分離檢測試劑瓶11。所述引物KRAS2-1和引物KRAS2-2的濃度均為5 u mo I/L ;所述KRAS2-1的上遊引物 5 ' -GAATGGTCCTGCACCAGTAA-3 '，下遊引物為 5 ' -GTGTGACATGTTCTAATATAGTCA-3 '；所述KRAS2-2的上遊引物5 ' -GTCCTGCACCAGTAATATGC-3 '，下遊引物為5' -ATGTTCTAATATAGTCACATTTTC-3'。所述酶混合物包括濃度為0. 4mmol/L 的 dNTPs, 4mmol/L 的 Mg2+, 2xBuffer,I. 25U/25 U I 的 HsTaq0所述電泳分離檢測試劑是Hi-DiFormamide試劑。本實用新型與現有產品相比，具有如下積極有益的效果[0010]本試劑盒結構簡單、設計合理、檢測過程不易受汙染；本試劑盒在檢測KRAS基因第2號外顯子突變時具有敏感性高、特異性強、耗時短等優點；本試劑盒設置檢品盒和輔助盒，檢測時更方便。
圖I為本實用新型的整體結構示意圖。
具體實施方式
以下結合附圖和實施例對本實用新型進行進ー步說明。如圖I所示，本實用新型的ー個實施例為KRAS基因第2號外顯子突變檢測試劑盒，ー種KRAS基因第2號外顯子突變檢測試劑盒，包括盒體I、盒蓋2，盒體I內設置擴增盒3和純化盒4 ;擴增盒3內設置有PCR管5、裝KRAS2-1引物的試劑瓶6、裝KRAS2-2引物的試劑瓶7、裝酶混合物的試劑管8、去離子水瓶9 ;純化盒4內設置有醋酸鈉溶液瓶10、電泳分離檢測試劑瓶11。所述引物KRAS2-1和引物KRAS2-2的的濃度均為5 u mo I/L ；所述KRAS2-1 的上遊引物 5' -GAATGGTCCTGCACCAGTAA-3'，下遊引物為5' -GTGTGACATGTTCTAATATAGTCA-3'；所述KRAS2-2 的上遊引物 5' -GTCCTGCACCAGTAATATGC-3'，下遊引物為5' -ATGTTCTAATATAGTCACATTTTC-3'。所述酶混合物包括濃度為0. 4mmol/L 的 dNTPs, 4mmol/L 的 Mg2+, 2xBuffer,
I.25U/25 U I 的 HsTaq0所述電泳分離檢測試劑是Hi-DiFormamide試劑。操作方法I)模板DNA的準備取病人腫瘤組織，常規提取DNA，純度0D260/0D280 = I. 6 2. 0，用量每反應60 lOOng。2)第一歩PCR反應將各反應物質按照如下反應體系進行配比模板DNA ；KRAS2-1上下遊引物各I U L ;酶混合物12.5 ii L ;滅菌去離子水補至25 Uし循環程序設置如下95 0C 5min ；95°C ^ 30s 64°C— 30s 72°C— 45s (35 循環);72 °C 7min ；4°C保存，2%瓊脂糖電泳，EB染色分析，目的帶為214bp。3)第二步PCR反應PCR產物I 2 ii L ；KRAS2-2上下遊引物各I U L ;酶混合物12. 5 ii L ;滅菌去離子水補至25 u L0循環程序設置如下95 0C 5min ；95°C^ 30s 64°C—30s 72°C—45s (35 循環)；72 °C 7min ；4°C保存，2%瓊脂糖電泳，EB染色分析，目的帶為204bp。4) PCR產物純化使用PCR產物純化試劑盒進行PCR產物純化。 5) PCR產物測序反應使用ABI公司試劑進行測序反應。6)測序產物純化每管加入2ul 3M的NaAC至PCR管底；每管加入50ul 100%酒精，震蕩混勻，室溫避光放置15min ；12，OOOXg 4°C離心30min，用移液槍吸盡上清；每管加入70ul 70%酒精，12，OOOXg 4°C離心15min，用移液槍吸盡上清；室溫揮發淨酒精，加入IOuL Hi-DiFormamide溶解DNA ；溶解後的樣品需要在95°C變性4min，迅速置冰中冷卻4min後，上樣電泳。7)結果判斷使用ABI3500自帶軟體進行分析。綜上所述，本實用新型所述的實施方式僅提供一種最佳的實施方式，本實用新型的技術內容及技術特點已掲示如上，然而熟悉本項技術的人士仍可能基於本實用新型所揭示的內容而作各種不背離本發明創作精神的替換及修飾；因此，本實用新型的保護範圍不限於實施例所掲示的技術內容，故凡依本實用新型的形狀、構造及原理所做的等效變化，均涵蓋在本實用新型的保護範圍內。
權利要求1. ー種KRAS基因第2號外顯子突變檢測試劑盒，其特徵在於，它包括盒體(I)、盒蓋(2)，盒體⑴內設置擴增盒(3)和純化盒⑷；擴增盒(3)內設置有PCR管(5)、裝KRAS2-1引物的試劑瓶出)、裝KRAS2-2引物的試劑瓶(7)、裝酶混合物的試劑管(8)、去離子水瓶(9);純化盒(4)內設置有醋酸鈉溶液瓶(10)、電泳分離檢測試劑瓶(11)。
專利摘要本實用新型公開了一種KRAS基因第2號外顯子突變檢測試劑盒，它包括盒體1、盒蓋2，盒體1內設置擴增盒3和純化盒4；擴增盒3內設置有PCR管5、裝KRAS2-1引物的試劑瓶6、裝KRAS2-2引物的試劑瓶7、裝酶混合物的試劑管8、去離子水瓶9；純化盒4內設置有醋酸鈉溶液瓶10、電泳分離檢測試劑瓶11。本試劑盒結構簡單、設計合理、檢測過程不易受汙染；本試劑盒在檢測KRAS基因第2號外顯子突變時具有敏感性高、特異性強、耗時短等優點；本試劑盒設置檢品盒和輔助盒，檢測時更方便。
文檔編號C12Q1/68GK202519264SQ20122016439
公開日2012年11月7日 申請日期2012年4月17日 優先權日2012年4月17日
發明者馮繼鋒, 吳建中, 唐金海, 曹海霞, 馬蓉 申請人:馮繼鋒, 吳建中, 唐金海, 曹海霞, 馬蓉