一種利用豬源生產犬用多聯高免血清的製備方法

2023-06-04 11:22:56 1

一種利用豬源生產犬用多聯高免血清的製備方法
【專利摘要】一種利用豬源生產犬用多聯高免血清的製備方法。本發明的技術方案要點是，一種治療豬脾胃虛寒型腹瀉的獸藥，選擇健康狀況良好的母豬，對其使用含有黃芪多糖的犬五聯活疫苗多次強化免疫，接種的方法為皮下或肌肉多點注射，接種的部位為頸部兩側或臀部兩側，接種劑量從首次的3-5頭份逐次遞增至15-20頭份，最後一次免疫劑量增加至20頭份，每次免疫間隔2-4周，最後一次免疫後2-4周，然後進行心臟採血，分離血清，再將血清滅活除菌，然後檢測抗體效價，其中犬瘟熱及狂犬病病毒中和抗體效價得到1:256以上，其餘病毒血凝抑制抗體效價達到1:256以上為適用。本發明所述的製備方法簡單易行，成本低廉，經濟實用，可廣泛用於犬主要疫病的緊急預防和治療。
【專利說明】一種利用豬源生產犬用多聯高免血清的製備方法
[0001]【技術領域】:
本發明涉及犬用多聯高免血清的製備，特別是一種利用豬源生產犬用多聯高免血清的製備方法。
[0002]【背景技術】:
隨著人民生活水平的提高，人們飼養犬的數量與日俱增，相應的犬病大量增加，如犬瘟熱、犬細小病毒病、犬傳染性肝炎、犬傳染性喉氣管炎、犬流感、犬副流感等嚴重影響犬的健康，一些人獸共患的疾病如狂犬病直接威脅人類健康。
[0003]目前，國內外已有多種抗病毒血清、抗細菌毒素或免疫球蛋白製劑應用於臨診實踐，用於疾病的緊急預防與治療，如抗狂犬病血清、破傷風抗毒素血清等，這些抗血清多數是使用馬屬動物或犬製備的，這些生物製品一方面工藝複雜，成本很高，另一方面用犬生產的抗血清由於來自於本種動物，不可避免會導致垂直傳播或水平傳播某種傳染病的可能。 [0004]
【發明內容】
:
本發明的是設計一種生產工藝簡單、產品效果好的利用豬源生產犬用多聯高免血清的製備方法。
[0005]本發明的技術方案是，一種利用豬源生產犬用多聯高免血清的製備方法，其特徵在於:選擇健康狀況良好的母豬，對其使用含有黃芪多糖的犬五聯活疫苗多次強化免疫，接種的方法為皮下或肌肉多點注射，接種的部位為頸部兩側或臀部兩側，接種劑量從首次的
3-5頭份逐次遞增至15-20頭份，最後一次免疫劑量增加至20頭份，每次免疫間隔2-4周，最後一次免疫後2-4周，然後進行心臟採血，分離血清，再將血清滅活除菌，然後檢測抗體效價，其中犬瘟熱及狂犬病病毒中和抗體效價得到1:256以上，其餘病毒血凝抑制抗體效價達到1:256以上為適用。所述的血清滅活除菌步驟為:收集的血清混合均勻，加入終濃度為 0.3%-0.5% 的 TNBP (磷酸三丁脂)和 1%-3% 的吐溫-80 或 l%-3%Triton-100, 24°C 6_8h ；再經6tlCo-Y射線輻照滅菌，輻照溫度為20°C，輻照劑量率為14.0Gy/min，輻照吸收劑量為12kGy。所述的含有黃芪多糖的犬五聯活疫苗，其黃芪多糖含量為80-320ug/ml。
[0006]本發明所述的製備方法簡單易行，成本低廉，經濟實用，可廣泛用於犬主要疫病的緊急預防和治療。
[0007]本發明的技術方案由如下過程組成:
1.免疫原:市售的犬五聯活疫苗；①美國輝瑞生產，預防犬瘟熱、犬腺病毒I型引起的傳染性肝炎、犬腺病毒2型引起的呼吸道病、犬副流感和犬細小病毒腸炎；②吉林五星藥廠生產，用於預防狂犬病、犬瘟熱、犬副流感、腺病毒感染及犬細小病毒感染。
[0008]2.動物免疫:
選擇體格較大，健康狀況良好，產仔6胎以上，繁殖力下降，無種用價值的淘汰母豬。在衛生狀況良好，專人管理的條件下飼養，對其使用上述添加黃芪多糖重量份數為80-320ug/ml的疫苗進行多次強化免疫。接種的方法為皮下或肌肉多點注射，接種的部位為頸部兩側或臀部兩側。
[0009]接種劑量從首次的3-5頭份逐次遞增至15-20頭份，最後一次免疫劑量增加至20頭份。每次免疫間隔2-4周，最後一次免疫後2-4周，檢測抗體效價。依據抗體效價確定強化免疫時間及採血時間。
[0010]3.血液採集及血清分離:
強化免疫後14-30d之間檢測抗體效價，達到規定的效價水平要求後即可採血。採血最好在上午空腹時進行，禁食時間在6h以上，可避免血中乳糜的發生從而獲得澄清的血清。將待採血母豬用清水衝洗乾淨後固定在「X」型的保定架上，使豬仰臥，將豬尾部墊高，將位於胸前口左側的被毛刮除乾淨，並用3%碘酒消毒，後用75%酒精脫碘，將事先消毒完好的空心銅管(一端尖、一端平，長40cm、直徑約Icm)平頭一端套上消毒完好的矽橡膠管，經消毒的胸前口捅入豬的心臟(不宜深入太長防止完全穿透心臟)，將膠管游離端插入預先裝有少量滅菌生理鹽水的離心管中收集血液，室溫放置，待血塊收縮完全後置4°C過夜，4000rpm離心20min收集血清。
[0011]4.血清滅活除菌
將上述收集的血清混合均勻，加入終濃度為0.3%-0.5%的TNBP (磷酸三丁脂)和1%_3%的吐溫-80或l%-3%Triton-100，24°C 6_8h ;再經60Co- Y射線輻照滅菌，輻照溫度為20°C，輻照劑量率為14.0Gy/min，輻照吸收劑量為12kGy。
[0012]5.效價測定
犬瘟熱及狂犬病病毒抗體通過微量中和試驗測定，犬副流感、腺病毒I型和2型及犬細小病毒病毒抗體均通過微量血凝抑制病毒試驗測定，犬瘟熱及狂犬病病毒中和抗體效價得到1:256以上，其餘病毒血凝抑制抗體效價達到1:256以上為合格。
[0013]6.無菌檢查
血清通過接種瓊脂平板，37°C培養48-72h看是否有菌落生長。
[0014]7.安全試驗
將上述無細菌生長的血清注射犬約10頭(5日齡-10日齡)(腹腔注射)5-10ml/頭，觀察一周(每日量體溫，觀察是否發病)，一切正常者為合格。
[0015]其它項按照中華人民共和國獸用生物製品質量標準(2001年版)中抗血清成品有關規定進行。
[0016]將合格的血清製品分裝，5ml/瓶，-18°C以下冷凍保存。
[0017]所述的黃芪多糖為廣西南寧市桃源獸藥廠生產的黃芪多糖注射液，含量為0.2g/10ml。
[0018]【具體實施方式】:
詳細描述實施例，
實施例1
1.免疫原:由美國輝瑞生產的犬五聯活疫苗。
[0019]2.動物免疫:
選擇體格較大，健康狀況良好，產仔6胎以上，繁殖力下降，無種用價值的淘汰母豬。在衛生狀況良好，專人管理的條件下飼養。對其使用上述添加黃芪多糖含量為80ug/ml的疫苗進行多次強化免疫。接種的方法為肌肉多點注射，接種的部位為頸部兩側。接種劑量首次5頭份/頭，第二次10頭份/頭，第三次免疫15頭份/頭，每次間隔2周，最後一次免疫劑量增加至20頭份/頭。最後一次免疫後2周，檢測抗體效價，犬瘟熱病毒中和抗體效價得到1:256以上，其餘病毒血凝抑制抗體效價達到1:256以上為合格。
[0020]3.血液採集及血清分離:
強化免疫後14-30d之間檢測抗體效價，達到規定的效價水平要求後即可採血。採血最好在上午空腹時進行，禁食時間在6h以上，可避免血中乳糜的發生從而獲得澄清的血清。將待採血母豬用清水衝洗乾淨後固定在「X」型的保定架上，使豬仰臥，將豬尾部墊高，將位於胸前口左側的被毛刮除乾淨，並用3%碘酒消毒，後用75%酒精脫碘，將事先消毒完好的空心銅管(一端尖、一端平，長40cm、直徑約Icm)平頭一端套上消毒完好的矽橡膠管，經消毒的胸前口捅入豬的心臟(不宜深入太長防止完全穿透心臟)，將膠管游離端插入預先裝有少量滅菌生理鹽水的離心管中收集血液，室溫放置，待血塊收縮完全後置4°C過夜，4000rpm離心20min收集血清。
[0021]4.血清滅活除菌
將上述收集的血清混合均勻，加入終濃度為0.5%的TNBP和1%的吐溫-80，240C 6h ；再經6tlCo-Y射線輻照滅菌，輻照溫度為20°C，輻照劑量率為14.0Gy/min，輻照吸收劑量為12kGy。
[0022]5.效價測定
犬瘟熱病毒抗體通過微量中和試驗測定，犬副流感、腺病毒I型和2型及犬細小病毒病毒抗體均通過微量血凝抑制病毒試驗測定，犬瘟熱病毒中和抗體效價得到1:256以上，其餘病毒血凝抑制抗體效價達到1:256以上為合格。
[0023]6.無菌檢查
血清通過接種瓊脂平板,37°C培 養48h無菌落生長為合格。
[0024]7.安全試驗
將上述無細菌生長的血清注射犬約10頭(5日齡-10日齡)(腹腔注射)5-10ml/頭，觀察一周(每日量體溫，觀察是否發病)，一切正常者為合格。
[0025]其它項按照中華人民共和國獸用生物製品質量標準(2001年版)中抗血清成品有關規定進行。
[0026]將合格的血清製品分裝，5ml/瓶，-18°C以下冷凍保存。
[0027]所述的黃芪多糖為廣西南寧市桃源獸藥廠生產的黃芪多糖注射液，含量為0.2g/10ml。
[0028]實施例2
1.免疫原:由吉林五星藥廠生產的犬五聯活疫苗。
[0029]2.動物免疫:
選擇體格較大，健康狀況良好，產仔6胎以上，繁殖力下降，無種用價值的淘汰母豬。在衛生狀況良好，專人管理的條件下飼養。對其使用上述添加黃芪多糖重量份數為160ug/ml的疫苗進行多次強化免疫。接種的方法為肌肉多點注射，接種的部位為頸部兩側。接種劑量首次5頭份/頭，第二次10頭份/頭，第三次免疫15頭份/頭，每次間隔2周，最後一次免疫劑量增加至20頭份/頭。最後一次免疫後2周，檢測抗體效價，犬瘟熱及狂犬病病毒中和抗體效價得到1:256以上，其餘病毒血凝抑制抗體效價達到1:256以上為合格。
[0030]3.血液採集及血清分離:
強化免疫後14-30d之間檢測抗體效價，達到規定的效價水平要求後即可採血。採血最好在上午空腹時進行，禁食時間在6h以上，可避免血中乳糜的發生從而獲得澄清的血清。將待採血母豬用清水衝洗乾淨後固定在「X」型的保定架上，使豬仰臥，將豬尾部墊高，將位於胸前口左側的被毛刮除乾淨，並用3%碘酒消毒，後用75%酒精脫碘，將事先消毒完好的空心銅管(一端尖、一端平，長40cm、直徑約Icm)平頭一端套上消毒完好的矽橡膠管，經消毒的胸前口捅入豬的心臟(不宜深入太長防止完全穿透心臟)，將膠管游離端插入預先裝有少量滅菌生理鹽水的離心管中收集血液，室溫放置，待血塊收縮完全後置4°C過夜，4000rpm離心20min收集血清。
[0031]4.血清滅活除菌
將上述收集的血清混合均勻，加入終濃度為0.4%的TNBP和2%的吐溫-80，24°C 6h ；再經6tlCo-Y射線輻照滅菌，輻照溫度為20°C，輻照劑量率為14.0Gy/min，輻照吸收劑量為12kGy。
[0032]5.效價測定
犬瘟熱及狂犬病病毒抗體通過微量中和試驗測定，犬副流感、腺病毒I型和2型及犬細小病毒病毒抗體均通過微量血凝抑制病毒試驗測定，犬瘟熱及狂犬病病毒中和抗體效價得到1:256以上，其餘病毒血凝抑制抗體效價達到1:256以上為合格。
[0033]6.無菌檢查
血清通過接種瓊脂平板,37°C培養48h無菌落生長為合格。
[0034]7.安全試驗
將上述無細菌生長的血清注射犬約10頭(5日齡-10日齡)(腹腔注射)5-10ml/頭，觀察一周(每日量體溫，觀察是否發病)，一切正常者為合格。
[0035]其它項按照中華人民共和國獸用生物製品質量標準(2001年版)中抗血清成品有關規定進行。
[0036]將合格的血清製品分裝，5ml/瓶，-18°C以下冷凍保存。
[0037]所述的黃芪多糖為廣西南寧市桃源獸藥廠生產的黃芪多糖注射液，含量為0.2g/10ml。
[0038]實施例3
1.免疫原:由美國輝瑞生產的犬五聯活疫苗。
[0039]2.動物免疫:
選擇體格較大，健康狀況良好，產仔6胎以上，繁殖力下降，無種用價值的淘汰母豬。在衛生狀況良好，專人管理的條件下飼養。對其使用上述添加黃芪多糖重量份數為320ug/ml的疫苗進行多次強化免疫。接種的方法為肌肉多點注射，接種的部位為頸部兩側。接種劑量首次5頭份/頭，第二次10頭份/頭，第三次免疫15頭份/頭，每次間隔2周，最後一次免疫劑量增加至20頭份/頭。最後一次免疫後2周，檢測抗體效價，犬瘟熱病毒中和抗體效價得到1:256以上，其餘病毒血凝抑制抗體效價達到1:256以上為合格。
[0040]3.血液採集及血清分離:
強化免疫後14-30d之間檢測抗體效價，達到規定的效價水平要求後即可採血。採血最好在上午空腹時進行，禁食時間在6h以上，可避免血中乳糜的發生從而獲得澄清的血清。將待採血母豬用清水衝洗乾淨後固定在「X」型的保定架上，使豬仰臥，將豬尾部墊高，將位於胸前口左側的被毛刮除乾淨，並用3%碘酒消毒，後用75%酒精脫碘，將事先消毒完好的空心銅管(一端尖、一端平，長40cm、直徑約Icm)平頭一端套上消毒完好的矽橡膠管，經消毒的胸前口捅入豬的心臟(不宜深入太長防止完全穿透心臟)，將膠管游離端插入預先裝有少量滅菌生理鹽水的離心管中收集血液，室溫放置，待血塊收縮完全後置4°C過夜，4000rpm離心20min收集血清。
[0041]4.血清滅活除菌
將上述收集的血清混合均勻，加入終濃度為0.3%的TNBP和3%的吐溫-80，24°C 6h ；再經6tlCo-Y射線輻照滅菌，輻照溫度為20°C，輻照劑量率為14.0Gy/min，輻照吸收劑量為12kGy。
[0042]5.效價測定
犬瘟熱抗體通過微量中和試驗測定，犬副流感、腺病毒I型和2型及犬細小病毒病毒抗體均通過微量血凝抑制病毒試驗測定，犬瘟熱病毒中和抗體效價得到1:256以上，其餘病毒血凝抑制抗體效價達到1:256以上為合格。
[0043]6.無菌檢 查
血清通過接種瓊脂平板,37°C培養48h無菌落生長為合格。
[0044]7.安全試驗
將上述無細菌生長的血清注射犬約10頭(5日齡-10日齡)(腹腔注射)5-10ml/頭，觀察一周(每日量體溫，觀察是否發病)，一切正常者為合格。
[0045]其它項按照中華人民共和國獸用生物製品質量標準(2001年版)中抗血清成品有關規定進行。
[0046]將合格的血清製品分裝，5ml/瓶，-18°C以下冷凍保存。
[0047]所述的黃芪多糖為廣西南寧市桃源獸藥廠生產的黃芪多糖注射液，含量為0.2g/10ml。
[0048]應用例:
1、新鄉市郊區一農戶，患犬初期糞便稀薄，體溫4 0.5°C，2d後，糞便呈番茄醬色或咖啡色，味腥臭，排便次數不定，有裡急後重的症狀，連續注射0.5-1.012-3d，K3，3d後症狀明顯減輕，一周後症狀消失，基本康復。
[0049]2.2011年以來，河南科技學院獸醫院對前來就診的表現高燒、下痢、便中帶血、咳嗽氣喘等症診斷為犬細小病毒病及犬瘟熱的患犬376隻，肌肉注射或皮下注射本產品
2-5ml/頭，同時配合K3及安乃近等進行對症治療，每天一次，連用2-3天，3天後症狀消失，治癒率達85%，有效率達90%，療效顯著。
[0050]本發明的豬源犬用多聯高免血清對治療早期的犬瘟熱、犬細小病毒病等疫病效果極好，與其它犬用多聯高免血清效果相當，而製備工藝簡單，價格低廉，優勢明顯。
【權利要求】
1.一種利用豬源生產犬用多聯高免血清的製備方法，其特徵在於:選擇健康狀況良好的母豬，對其使用含有黃芪多糖的犬五聯活疫苗多次強化免疫，接種的方法為皮下或肌肉多點注射，接種的部位為頸部兩側或臀部兩側，接種劑量從首次的3-5頭份逐次遞增至15-20頭份，最後一次免疫劑量增加至20頭份，每次免疫間隔2-4周，最後一次免疫後2-4周，然後進行心臟採血，分離血清，再將血清滅活除菌，然後檢測抗體效價，其中犬瘟熱及狂犬病病毒中和抗體效價得到1:256以上，其餘病毒血凝抑制抗體效價達到1:256以上為適用。
2.如權利要求1所述的一種利用豬源生產犬用多聯高免血清的製備方法，其特徵在於:血清滅活除菌步驟為:收集的血清混合均勻，加入終濃度為0.3%-0.5%的TNBP (磷酸三丁脂)和1%_3%的吐溫-80或l%-3%Triton-100，24°C 6_8h ;再經60Co- Y射線輻照滅菌，輻照溫度為20°C，輻照劑量率為14.0Gy/min，輻照吸收劑量為12kGy。
3.如權利要求1所述的一種利用豬源生產犬用多聯高免血清的製備方法，其特徵在於:所述的含有黃芪多糖的犬五聯活疫苗，其黃芪
多糖320ug/ml。
【文檔編號】A61K39/39GK103585627SQ201310550849
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月9日 優先權日:2013年11月9日
【發明者】姚四新, 歐長波, 趙淑秋, 劉興友, 胡建和 申請人:河南科技學院