一種定量檢測生鮮牛乳中β-內醯胺酶殘留含量的測定方法

2023-06-04 03:17:41

專利名稱：一種定量檢測生鮮牛乳中β-內醯胺酶殘留含量的測定方法
技術領域：
本發明涉及一種定量檢測生鮮牛乳中β -內醯胺酶殘留含量的測定方法。
背景技術：
β -內醯胺酶是一種近年來才開始引起大家關注的食品添加劑，主要添加在牛奶中以生產無抗奶(指用不含抗生素的原料生產出來的牛奶)。內醯胺酶作為牛奶中抗生素分解劑(解抗劑)，最初是科研人員作為一項科研成果推出的。這種做法可有效分解牛奶中殘留的β-內醯胺類抗生素。但是應用β-內醯胺酶分解牛奶中抗生素的風險在於 (1)人體大量攝入β-內醯胺酶可能會導致人體產生細菌耐藥性，因此行政主管部門已經明令禁止在生鮮乳中添加；( 在分解β -內醯胺藥物後，可能引進其他有害物質(青黴素噻唑酸等)；C3)解抗劑的添加縱容了奶牛飼養過程中抗生素的濫用。正因為如此，衛生部於2009年2月正式公布了《食品中可能違法添加的非食用物質名單(第二批)》，其中明確認定內醯胺酶是屬於違法添加的非食用物質，其作用就是掩蔽抗生素。雖然衛生部已經明文規定β -內醯胺酶屬於不安全食品添加劑，但是，由於細菌耐藥產生的內源性β -內醯胺酶有300多種，且內源性、外源性β -內醯胺酶的區別鑑定檢測技術尚未見報導。而目前各檢測機構正在研究的生鮮牛乳中內醯胺酶的檢測方法無論是儀器分析、色譜法、配體-受體法還是微生物法，都存在一個不確定因素，即測出的 β-內醯胺酶無法判定是人為添加(外源性)的或是耐藥細菌產生(內源性)的。也就是說，乳製品中檢出的內醯胺酶有可能是非法添加的，也有可能是細菌產生的。在尚未制定內醯胺酶殘留限量標準的前提下，獲得完整的定量檢測數據將是監督部門制定限量標準的重要依據。因此內醯胺酶定量檢測方法的研究應運而生。生鮮牛乳中的β -內醯胺酶殘留檢測從方法學上可以分為以下兩種1)通過測定未分解的酶促反應底物(青黴素)的含量來間接推算體系中內醯胺酶的濃度。該方法以生物測定法(杯碟法)及配體-受體檢測法為代表，其特點是原理明確、特異性強。2)通過測定底物青黴素分解產物的方法，青黴素經過內醯胺酶的分解之後生成穩定的中間產物-青黴噻唑酸，通過測定體系中青黴噻唑酸的含量將能夠計算出β -內醯胺酶的含量。 該方法以碘量法、產色頭孢菌素法為代表。但是，上述兩類檢測方法都存在一定的缺陷。無論上述哪一種方法都還不能做到定量化，而測定未分解的酶促反應底物的方法又存在時間長、成本高的缺陷。同時，內醯胺酶作為一類小分子的蛋白09kDa 39kDa)混在大量的蛋白、胺基酸乳濁液(牛奶)中， 如果缺乏有效的檢測手段則很難將其特異性分離。因此，找到一種既能精確定量又能快速、 高效檢測出內醯胺酶殘留的方法勢在必行
發明內容
本發明所要解決的技術問題在於提供一種定量檢測生鮮牛乳中β -內醯胺酶殘留含量的測定方法。本發明借鑑經典的碘量法，利用其快速高效重複性好的特點，克服其原先只能採用比色法作為定性分析的技術瓶頸，採用可見光比色法，藉助分光光度計、酶標儀等簡單儀器，即能快速定量檢測β -內醯胺酶的殘留量。本發明的定量檢測生鮮牛乳中β -內醯胺酶殘留含量的測定方法，利用β -內醯胺酶可分解牛奶樣品中β-內醯胺類抗生素的原理，通過測定與β-內醯胺酶反應後分解出的青黴素噻唑酸的含量來檢測牛奶中殘留β-內醯胺酶的含量。首先，本發明的測定方法是根據青黴素G經內醯胺酶作用而產生的裂解酸與碘結合，可使藍色的碘澱粉複合物褪色的原理而設計的。反應式如下青黴素G+β -內醯胺酶一青黴素噻唑酸青黴素噻唑酸+碘-澱粉(藍色)一褪至白色碘量法定量分析原理是基於水解ImoL青黴素大約相當於SmoL碘，以青黴素作底物時Perret碘法應用最廣。作為一種特殊的指示劑，本發明採用可溶性澱粉與游離碘生成深藍色絡和物的專屬反應來指示滴定終點。當I2溶液的濃度為5X10-6mol/L時即能看到藍色，極其靈敏。一直以來碘量法定量受到實驗條件限制(反應溫度要求精確、反應時間控制嚴格)，僅僅是作為定性方法作為確證方法的前期篩選。隨著比色法的相關設備開發越來越成熟(溫度控制酶標儀、生化儀及其它相關儀器設備已經廣泛應用)，碘量法應用於微量物質的定量測定也有不少應用。本發明的定量測定方法將碘量法、比色法結合利用，採用澱粉和青黴素噻唑酸 (ΒΡΑ，β -內醯胺酶分解底物產生)競爭結合碘造成其顏色深淺不同的原理，產生顏色的深淺與被分解物的濃度成反比，再用分光光度裝置顯示顏色深淺的程度。吸光度值與標準曲線對比後，實現精確定量。本發明定量檢測方法具體步驟如下1)試樣製備取經檢測不含β -內醯胺酶的生鮮牛乳樣品，恢復至室溫，充分混勻後備用。2)打開水浴鍋，調節溫度備用。3)用稀釋液將濃縮標準品稀釋至10U/mL、8U/mL、6U/mL、4U/mL、2U/mL、0U/mL濃度的β-內醯胺酶標準品。4)取待測樣品加入樣品管中，同時各取稀釋液、β內醯胺酶標準品分別加入樣品管中。5)將上述各管混勻後孵育。6)向孵育後的樣品管中加入樣品處理液，充分混勻後離心。7)取清液加入96孔板中，並加入等體積混合的試劑A和試劑B。8)讀取吸光度。9)結果判讀，用578nm下的吸光度OD值，並使用標準曲線計算。①計算Δ OD值，即以OU/mL的β內醯胺酶所得吸光度ODtl值為基準，用其它濃度的β內醯胺酶標準品溶液所得ODi值減去OU/mL的β內醯胺酶所得吸光度ODtl值。AOD = ODi-OD0
②以AOD值為縱坐標，以β-內醯胺酶濃度為橫坐標，做標準曲線，圖1即為 β-內醯胺酶的標準曲線。③根據每個樣品的AOD值就可從曲線上讀出相對應樣品的濃度。10)準確度在重複性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值，使其不得超過算術平均值的20%。上述方法中，所述稀釋液是ρΗ為6. 5的磷酸緩衝液，濃縮標準品是濃度為200U的內醯胺酶溶液，。上述方法中，所述試劑A為碘溶液，所述試劑B為澱粉溶液。上述方法中，所述樣品處理液為ρΗ4. 8的醋酸緩衝液。上述方法中，所述樣品管中事先含定量的(IOOyg)青黴素G標準品，購自中國藥品生物製品檢定所。根據上述方法，本發明對生鮮牛乳中β -內醯胺酶檢測靈敏度達到0. 5U/mL，定量線性範圍為OU/mL 10U/mL。


圖1為β -內醯胺酶的標準曲線，其中R為相關係數。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步的闡述，應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。本發明的試劑和材料除非另有規定，均為分析純試劑；實驗用水應符合GB/T6682 中三級水要求或相當純度的水。實施例1β-內醯胺酶的測定1)試樣製備取經檢測不含β -內醯胺酶的生鮮牛乳樣品，恢復至室溫，充分混勻後備用。2)分析步驟①打開水浴鍋，調節溫度到37°C備用。②用稀釋液將200U濃縮β內醯胺酶標準品稀釋至1 OU/mL、8U/mL、6U/mL、4U/mL、 2U/mL、OU/mL濃度的β內醯胺酶標準品。③取800 μ L待測樣品加入樣品管中，同時各取800 μ L稀釋液、β內醯胺酶標準品分別加入樣品管中。④將上述各管混勻後37°C孵育30min。⑤向孵育後的樣品管中加入800 μ L樣品處理液，充分混勻後以4000rpm離心 5min。⑥取清液200 μ L加入96孔板中，並加入50 μ L (等體積混合的試劑A和試劑B)。⑦578nm下讀取吸光度。
3)結果判讀①計算AOD值，即以OU/mL的β內醯胺酶所得吸光度ODtl值為基準，用其它濃度的β內醯胺酶標準品溶液所得ODi值減去OU/mL的β內醯胺酶所得吸光度ODtl值。AOD = ODi-OD0②以Δ OD值為縱坐標，以β -內醯胺酶濃度為橫坐標，做標準曲線，圖1為β -內醯胺酶的標準曲線，其中R為相關係數。③根據每個樣品的AOD值就可從曲線上讀出相對應樣品的濃度。實施例2β -內醯胺酶參照物質活力的測定本發明標定β -內醯胺酶活力濃度的方法是參考《中國藥典》(2005版二部)定義的β -內醯胺酶活力測定方法37°C、60分鐘內β -內醯胺酶轉化底物(青黴素)成為青黴噻唑酸，青黴噻唑酸競爭與澱粉競爭結合12。澱粉作為專屬指示劑；硫代硫酸鈉溶液為標準溶液；精確測定β -內醯胺酶的活性濃度。本發明採用上述測定方法標定了 β -內醯胺酶的校準品(濃度為10000U/mL的β 內醯胺酶標準品)、濃縮標準品(濃度為200U/mL的β內醯胺酶標準品)、質控品(濃度為 5U/mL的β -內醯胺酶標準品)。實施例3β -內醯胺酶的定量方法1)比色法測定β -內醯胺酶的波長UV-2300紫外可見分光光度計全波長掃描顯示碘-澱粉溶液最大吸收峰為 578nm，碘溶液最大吸收峰為351nm。2)酶反應動力學定量方法本發明採用終點法定量測定內醯胺酶即酶作用一段時間後，測定單位時間內產物生成量，計算酶促反應的平均速度。3)酶動力學法定量β -內醯胺酶酶活力的理論依據酶活性(U/mL)=平均吸光度值/時間X因子(F)F因子=總體積X 1000/樣品量XtXeXs其中t =測試時間(min)，e =摩爾消光係數，s =流通池光程(cm)C 測=Δ A/minX F其中ΔΑ/min指平均每分鐘吸光度的變化值，F同上。實施例4碘量法-比色法定量檢測β -內醯胺酶的方法學驗證1)標準曲線按實施例1的操作方法，重複三次測定標準曲線，結果如表1和表2所示。表 1
次數標準品1標準品2標準品3標準品4標準品5標準品612. 2241. 9011. 3531. 2230. 8560. 31權利要求
1.一種定量檢測生鮮牛乳中β-內醯胺酶殘留含量的測定方法，其特徵在於，利用 β-內醯胺酶能夠分解牛奶樣品中β-內醯胺類抗生素的原理，通過測定與β-內醯胺酶反應後分解出的青黴素噻唑酸的含量來檢測牛奶中殘留的β -內醯胺酶；具體包括以下步驟1)試樣製備取經檢測不含β-內醯胺酶的生鮮牛乳樣品，恢復至室溫，充分混勻後備用；2)打開水浴鍋，調節溫度備用；3)用稀釋液將濃縮標準品稀釋成不同濃度的標準品；4)取待測樣品加入樣品管中，同時各取稀釋液、標準品分別加入樣品管中；5)將上述各管混勻後孵育；6)向孵育後的樣品管中加入樣品處理液，充分混勻後離心；7)取清液加入96孔板中，並加入等體積混合的試劑A和試劑B；8)讀取吸光度；9)結果判讀。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述稀釋液是PH為6.5的磷酸緩衝液，所述濃縮標準品是濃度為200U的β -內醯胺酶溶液。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述標準品是濃度分別為10U/mL、8U/mL、 6U/mL、4U/mL、2U/mL、0U/mL 的 β -內醯胺酶標準品。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述試劑A為碘溶液，所述試劑B為澱粉溶液。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述樣品處理液為ρΗ4.8的醋酸緩衝液。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述樣品管中已放有100μ g青黴素G標準品。
全文摘要
本發明公開了一種定量檢測生鮮牛乳中β-內醯胺酶殘留含量的測定方法，利用β-內醯胺酶能夠分解牛奶樣品中β-內醯胺類抗生素的原理，通過測定與β-內醯胺酶反應後分解出的青黴素噻唑酸的含量來檢測牛奶中殘留的β-內醯胺酶。根據本發明的測定方法，對生鮮牛乳中β-內醯胺酶檢測靈敏度達到0.5U/mL，定量線性範圍為0U/mL～10U/mL。
文檔編號G01N21/31GK102212607SQ20101013907
公開日2011年10月12日 申請日期2010年4月2日 優先權日2010年4月2日
發明者張琪, 李康, 梁俊, 肖理文, 胡佳駿, 郭曉梅 申請人:上海優你生物科技股份有限公司