一種非致病性遲緩愛德華氏菌的應用的製作方法

2023-06-04 16:46:41

專利名稱：一種非致病性遲緩愛德華氏菌的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及免疫學和微生物學領域，具體的說是一種非致病性遲緩愛德華氏菌的
應用。
背景技術：
遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)是一種重要的養殖水產生物病原菌，能 夠感染多種海水和淡水魚類，包括牙鮃、大菱鮃、羅非魚、真鯛、鰻魚等，每年給水產養殖業 造成巨大的經濟損失。另外，除了魚類外，遲緩愛德華氏菌還能感染人類和陸棲動物，在人 類中造成急性胃腸炎、傷口感染、敗血病等；因而該菌是一種典型的人/畜/魚共患性病原 菌。對於遲緩愛德華氏菌病的防治，目前除了一種滅活疫苗最近在韓國應用外，世界上尚無 其它商業化疫苗。發明人課題組以及其他研究人員曾報導幾種在實驗室範圍內有效的遲緩 愛德華氏菌疫苗，但這些疫苗都是來自於致病性遲緩愛德華氏菌，基於非致病性的遲緩愛 德華氏菌疫苗尚未見報導。

發明內容
本發明目的在於提供一種非致病性遲緩愛德華氏菌的應用。
為實現上述目的，本發明採用的技術方案為 —種非致病性遲緩愛德華氏菌的應用所述非致病性遲緩愛德華氏菌對致病性遲 緩愛德華氏菌感染具有免疫保護效應；所述非致病性遲緩愛德華氏菌為遲緩愛德華氏菌 15947。 所述對致病性遲緩愛德華氏菌感染具有免疫保護效應的為非致病性遲緩愛德華 氏菌的菌懸液。所述非致病性遲緩愛德華氏菌的菌懸液為將非致病性遲緩愛德華氏菌在LB 培養基中於28°C，以160rpm搖動培養至0D6。。為0. 8-l，離心收集菌體，即為非致病性遲緩 愛德華氏菌的菌懸液。所述離心收集的菌體懸浮於PBS中至終濃度為4xl8cfu/ml。所述 非致病性遲緩愛德華氏菌的菌懸液腹腔注射於魚類，注射量為100ul。
本發明具有如下優點 1.高保護率。本發明的疫苗對致病性遲緩愛德華氏菌侵染的相對免疫保護效率可 達100%。 2.應用簡單。本發明的疫苗製備過程簡單，只需常規的細菌培養，不涉及任何其它 處理。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步說明。實施例旨在對本發明進行舉例描述，而
非以任何形式對本發明進行限制。 實施例l 非致病性遲緩愛德華氏菌對致病性遲緩愛德華氏菌感染具有免疫保護效應。所述非致病性遲緩愛德華氏菌為遲緩愛德華氏菌15947 (Tan YP， Lin Q， Wang XH， JoshiS， Hew C， Leung KY. Comparative proteomic analysis of extracellular proteinsofEdwardsiella tarda. Infect Immun 2002;70:6475-80.)。非致病性毒力檢測表明，用15947和其它典型的致病性遲緩愛德華氏菌感染藍曼龍(Trichogastertrichopterus)( —種魚)，15947的半致死量(LD50)是典型致病性遲緩愛德華氏菌的50-500倍，由此將15947劃分為非致病性遲緩愛德華氏菌。 對致病性遲緩愛德華氏菌感染具有免疫保護效應的為非致病性遲緩愛德華氏菌的菌懸液。具體為將遲緩愛德華氏菌15947(購於美國AmericanType Culture Collection,編號ATCC 15947)在LB液體培養基中過夜培養；取O. 1ml過夜後的培養液，將其加入10ml新鮮的LB液體培養基中，於28t:轉速160rpm搖動培養至0D6。。為0. 8_1，而後將細菌培養液離心(5000g，4°C， 10min)，收集菌體，將其懸浮於PBS中至終濃度為4xl08cfu/ml，即為非致病性遲緩愛德華氏菌的菌懸液。 所述LB組成成分按重量百分比計1.0%蛋白腖，0.5%酵母粉，1.0%氯化鈉，97. 5%蒸餾水；所述PBS組成成分按重量百分比計0.8% NaCl，O. 02% KCl，O. 358 %Na2HP04. 12H20，0. 024% NaH2P04。 免疫注射將44條牙鉀(每條重約10g)隨機分為2組，每組22條。將這2組分別命名為A和B。將A組的每條魚分別腹腔注射lOOul上述非致病性遲緩愛德華氏菌的菌懸液。將B組的每條魚分別腹腔注射100ulPBS。 20天後，再次將A組的每條魚分別腹腔注射lOOul上述非致病性遲緩愛德華氏菌的菌懸液，將B組的每條魚分別腹腔注射lOOul PBS。
致病性遲緩愛德華氏菌懸液的製備在LB培養基中培養遲緩愛德華氏菌TXl至0D6。。為0.6，然後離心(5000g，4°C )10min。收集菌體，將其懸浮於PBS中至終濃度為4xl07cfu/ml，即為致病性遲緩愛德華氏菌懸液。 所述遲緩愛德華氏菌TXl保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為CGMCC No. 2330。 疫苗的免疫保護效應檢測在免疫注射第一次注射後的第35天，用上述的致病性遲緩愛德華氏菌懸液腹腔注射上述A和B組魚，每條魚的注射量為100ul。在以後的20天中，每天觀察並記錄各組魚的死亡情況。20天後，統計各組魚的總死亡數目A組，O條；B組，18條。利用下列公式計算相對免疫保護效率(RPS): RPS = lOOx(l-免疫組魚的總死亡百分比/對照組魚的總死亡百分比)由此得出遲緩愛德華氏菌15947，非致病性遲緩愛德華氏菌針對致病性遲緩愛德華氏菌感染的免疫保護效率為100%。
權利要求
一種非致病性遲緩愛德華氏菌的應用，其特徵在於所述非致病性遲緩愛德華氏菌對致病性遲緩愛德華氏菌感染具有免疫保護效應；所述非致病性遲緩愛德華氏菌為遲緩愛德華氏菌15947。
2. 按權利要求1所述的非致病性遲緩愛德華氏菌的應用，其特徵在於所述對致病性 遲緩愛德華氏菌感染具有免疫保護效應的為非致病性遲緩愛德華氏菌的菌懸液。
3. 按權利要求1所述的非致病性遲緩愛德華氏菌的應用，其特徵在於所述非致病性遲緩愛德華氏菌的菌懸液為將非致病性遲緩愛德華氏菌在LB培養基中於28°C，以160rpm 搖動培養至0D6。。為0. 8-l，離心收集菌體，即為非致病性遲緩愛德華氏菌的菌懸液。
4. 按權利要求3所述的非致病性遲緩愛德華氏菌的應用，其特徵在於所述離心收集 的菌體懸浮於PBS中至終濃度為4xl08cfu/ml。
5. 按權利要求1所述的非致病性遲緩愛德華氏菌的應用，其特徵在於所述非致病性 遲緩愛德華氏菌的菌懸液腹腔注射於魚類，注射量為lOOul。
全文摘要
本發明涉及免疫學和微生物學領域，具體的說是一種非致病性遲緩愛德華氏菌的應用。所述非致病性遲緩愛德華氏菌對致病性遲緩愛德華氏菌感染具有免疫保護效應。本發明所得非致病性遲緩愛德華氏菌對致病性遲緩愛德華氏菌有高保護作用，其製備及免疫操作簡單，無需任何處理過程。
文檔編號A61P31/00GK101721692SQ20091023054
公開日2010年6月9日 申請日期2009年11月27日 優先權日2009年11月27日
發明者孫黎, 程爽 申請人:中國科學院海洋研究所