一種姜花花部特異和傷害、蟲害誘導的tps2啟動子及其應用的製作方法

2023-06-04 12:48:21

一種姜花花部特異和傷害、蟲害誘導的tps2啟動子及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬於基因工程【技術領域】，具體公開了一種姜花花部特異和受傷害、蟲害誘導的TPS2啟動子及其應用。所述啟動子的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。本發明所述TPS2啟動子調控的目的基因在轉基因菸草中僅在花組織表達，其表達與花發育進程有關，且表達受傷害和蟲害的誘導。而且本發明所述TPS2啟動子可以連接到任意一種植物轉化載體，然後導入姜花或其它植物細胞中，可獲得含有所述啟動子的轉基因花香和抗性，從而用於生產；也可以根據本發明所述啟動子序列信息產生特異性的分子標記，用於鑑定姜花或其它植物的花香和抗性基因型，用於分子標記輔助選擇育種，從而提高育種的選擇效率。
【專利說明】一種姜花花部特異和傷害、蟲害誘導的TPS2啟動子及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程【技術領域】，具體地，涉及一種姜花花部特異和傷害、蟲害誘導的TPS2啟動子及其應用。
【背景技術】
[0002]啟動子是位於結構基因5'端上遊區的一段能識別並活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準確地結合，確保轉錄精確而有效地起始的DNA序列。它是植物基因轉錄調控的中心，是理解基因轉錄調控機制和表達模式的關鍵。
[0003]根據啟動子的轉錄模式可將其分為:組成型啟動子、組織或器官特異性啟動子和誘導型啟動子。其中，組織特異型啟動子亦稱為器官特異啟動子，包括果實特異啟動子、根特異啟動子、葉特異啟動子及花器官特異啟動子等。在這類啟動子的調控下，基因的表達往往只限於某些特定的器官或組織部位，並往往表現發育調控的特性。
[0004]花器官特異表達啟動子可使目的基因在花中特異性表達，可有效控制目的基因在花中特異表達且與花發育進程密切相關，此外，花器官基因作用時還會受到許多誘導型等調控元件的協同作用。矮牽牛CHS的調控元件發現其中的一個G-box，是相關轉錄因子的結合域，是光、厭氧生活和ABA應答元件，受光和紫外線誘導調控，與花特異表達有關(洪亞輝等，2003)。當植物受到人為的創傷或害蟲造成的機械損傷後，會產生一些小分子物質和多糖，它們作為信號物質誘導一系列防禦基因的表達。土豆損傷基因蛋白酶抑制劑基因Pin II啟動子傷誘導區域在啟動子的近端區域，將-700~-195區段與_90CaMV35S啟動子融合，發現嵌合啟動子具有傷誘導的活性，因此認為該區段控制該基因的傷誘導表達。
[0005]花器官特異啟動子不僅含有所必須的保守性順式元件外，還含有一些組織特異型和誘導型啟動子的特有序列。並且這種的組織特異性通常以特定的組織細胞結構和化學物理信號為基礎，由這類啟動子中同時存在幾種控制組織特異性表達的元件的種類、數目及相對位置等共同決定。 [0006]目前對轉基因技術中啟動子的選擇主要採用組成型啟動子，在組成型表達啟動子的控制下，外源基因在轉基因植物的所有部位和不同的發育階段都會表達，且持續、高效的表達，沒有時空特異性，造成了能量的損耗，影響陽性植株的成活率，引起植株生理和形態發生異常改變，從而影響植物的正常生長發育。由於組織特異和誘導型啟動子能夠有效地調控下遊基因的表達，最大限度地減少由於外源蛋白在轉基因植物體內的積累對其自身造成的傷害。Kasuga 等將 rd29A::DREBlA 和 35S::DREBlA 轉化菸草，與 rd29A::DREBlA 轉基因植株相比，35S::DREBlA轉基因菸草明顯出現生長滯後現象；rd29A::DREBlA轉基因植株的脅迫耐性也明顯高於35S::DREBlA轉基因植株。Pellegrineschi用脅迫誘導型啟動子rd29A驅動DREB1A/CBF3的表達，提高了轉基因小麥對乾旱脅迫的耐性，而且沒有引起明顯的畸形。
[0007]花作為植物重要的生殖器官，在利用植物雜種優勢人工創建不育系、以花器官的表達元件研究一些基因特別是轉錄因子的功能等基因工程研究中起重要作用。其中花葯特異表達啟動子和花粉啟動子起到了十分重要的作用。利用花葯絨氈層特異啟動子TA29、A9等構建雄性不育基因，創造雄性不育性植株已在菸草、油菜等獲得成功。常小麗(2009)將從百合中克隆到的花部特異的CHS基因啟動子轉入擬南芥中發現，在轉化植株的花序部位具有特異性表達。Kobayashi等發現,從三花龍膽(Getiana triflora)中克隆得到的CHS基因啟動子可在矮牽牛的花瓣唇部特異性表達。Lewinsohn等採用E8啟動子,將仙女扇的LIS基因導入番爺，成熟的果實合成並釋放香氣明顯的S-芳樟醇和8-羥基芳樟醇。Davidovich等(2007)採用PG啟動子，將檸檬羅烯香葉醇合成酶(GES)基因轉入番茄，該基因在轉基因番茄果實中過量表達導致香葉醇的積累量增加，成功的改變番茄果實風味。
[0008]隨著植物基因工程技術的發展，組織特異和誘導型啟動子可用於人為控制目標基因在植株的特定發育時期、特殊組織器官和相關逆境條件下精確表達，在改良作物的抗性、提高花卉的觀賞狀、改善果實和蔬菜的風味等方面具有重要的應用前景。

【發明內容】

[0009]本發明的目的為了克服現有技術中對姜花花部特異和傷害、蟲害誘導啟動子的研究鮮見報導的缺陷，提供一種姜花花部特異和傷害、蟲害誘導的TPS2啟動子。
[0010]本發明的另一個目的是提供一種姜花花部特異和傷害、蟲害誘導的TPS2啟動子在培育改變花色、花香和育性等花部特有性狀及提高抗蟲能力的植物新品種的應用。
[0011]本發明通過以下技術方案予以實現上述目的:
[0012]一種姜花花部特異和傷害、蟲害誘導的TPS2啟動子，其核苷酸序列如SEQIDN0:2所示。該啟動子總長度為1922bp，分段長度分別為782bp和321bp。TPS2啟動子賦予姜花花香基因HcTPS2花部特異和傷害、蟲害誘導表達特徵。本發明所述的TPS2啟動子序列與⑶S基因融合表達轉化菸草後`，目標基因在菸草僅花組織表達，其表達與花發育進程有關，並且在葉片中表達受傷害、蟲害和茉莉酸甲酯誘導。
[0013]經過軟體分析得到所述TPS2啟動子含有3個5'端系列缺失的目的片段p_320、p-780 和 p-1928, p-320、p-780 和 p-1928 的序列如 SEQIDN0:2 ~4 所示。
[0014]一種重組載體，所述重組載體為在出發載體的多克隆位點插入如上所述TPS2啟動子序列(SEQIDN0:2)。所述出發載體可以是本【技術領域】中經常用到的所有類型的植物表達載體，優選地，本發明所用的植物表達載體為PCAMBIA1300G植物表達載體。
[0015]一種重組載體，所述重組載體為在出發載體的多克隆位點插入如上所述TPS2啟動子的5'端系列缺失的目的片段p-320、p-780或p-1928序列。所述出發載體可以是本【技術領域】中經常用到的所有類型的植物表達載體，優選地，本發明所用的植物表達載體為PCAMBIA1300G植物表達載體。
[0016]一種包含如上所述重組載體的重組菌。
[0017]一種包含如上所述重組載體的細胞系。
[0018]TPS2啟動子在培育改變花色、花香和育性等花部特有性狀及提高抗蟲能力的轉基因植物新品種的應用。
[0019]一種培育轉基因花香或抗性植物的方法，具體步驟為:將含有如上所述的重組載體導入出發植物細胞，從而得到TPS2啟動子啟動目的基因表達的轉基因花香或抗性植物。[0020]優選地，所述目的基因為⑶S基因。
[0021]本發明同樣包括將三種長度的啟動子片段作為主要結構部分有效地連接上合適的目標功能基因所形成的嵌合基因，以及在基因組中包含這種啟動子片段的植物和這種植物的種子。
[0022]根據本發明提供的啟動子DNA序列信息，本領域技術人員可以通過以下方法容易地獲得等同的啟動子DNA序列:(I)通過資料庫檢索獲得；(2)以啟動子DNA片段為探針篩選姜花或其它植物的基因組文庫獲得；(3)根據啟動子DNA序列信息設計寡核苷酸引物，用PCR擴增的方法從姜花或其它植物的基因組中獲取；(4)在啟動子DNA序列的基礎上用基因工程方法改造獲得；(5)用化學合成的方法獲得。
[0023]本發明提供的啟動子DNA序列具有重要的應用價值。應用之一是將所述的啟動子DNA序列連接到任何一種植物轉化載體，用任何一種轉化方法將啟動子DNA序列導入植物細胞，可獲得表達所述花部特異和傷害、蟲害誘導表達特徵，從而應用於生產。本發明所述的啟動子DNA序列構建到植物轉化載體中，可以對融合表達的下遊基因進行調控，從而增強植物產生花香和增強抗性等能力。
[0024]本發明提供的啟動子DNA序列的另一個應用是根據所述基因序列信息產生特異性的分子標記，包括但不限於SNP (單核苷酸多態)、SSR (簡單序列重複多態)、RFLP (限制性內切酶長度多態)、CAP (切割擴增片段多態)。用這些標記可鑑定姜花或其它植物的花香基因型，用於分子標記輔助選擇育種，從而提高育種的選擇效率。
[0025]與現有技術相比，本發明具有以下有益效果:
[0026]本發明將克隆的TPS2啟動子DNA序列與控制花色、花香和抗性目標功能基因結合，有助於產生新的花色、花香和抗 性植物，而且不會產生傳統育種技術中伴隨出現的基因組中不良基因的連鎖問題，並且可以縮短育種時間。另外，本發明能夠進一步提供或應用上述TPS2啟動子DNA片段獲得的新花色、花香和抗性的轉基因植株和相應的種子，以及用本發明的重組體轉化的植株或由這類植株獲得的種子。可以用有性雜交的方式將本發明的啟動子轉入其他的植株。
[0027]說明書附圖
[0028]圖1.TPS2啟動子與⑶S融合表達的轉基因菸草⑶S在不同組織表達特異性；a:不同組織⑶S染色情況；b:不同組織⑶S酶活力情況。
[0029]圖2.TPS2啟動子與⑶S融合表達的轉基因菸草⑶S在花器官不同發育時期的表達;A:不同發育時期GUS染色情況，其中圖示I為未開放的花苞；2為半開狀態的花瓣；3為盛開狀態下的花瓣；4為衰老的花瓣；B:不同發育時期GUS酶活力情況，其中圖示I~4同A。
[0030]圖3.不同長度片段TPS2啟動子與GUS融合表達的轉基因菸草GUS在花瓣中茉莉酸甲酯處理，傷害處理後的表達；A:不同處理後花瓣中GUS染色情況；B:不同處理後花瓣中GUS酶活力情況；圖示I為未處理的花瓣，2為茉莉酸甲酯處理的花瓣，3為傷害處理的花瓣。
[0031]圖4.TPS2啟動子與GUS融合表達的轉基因菸草GUS在葉片中茉莉酸甲酯，傷害和蟲害的誘導表達；A:不同處理後葉片中GUS染色情況；B:不同處理後葉片中GUS酶活力情況，圖示I為未處理，2為茉莉酸甲酯處理，3為傷害處理，4為蟲害處理。[0032]圖5.不同長度片段TPS2啟動子與GUS融合表達的轉基因菸草植株的PCR檢測圖；A:P-1928轉基因植株PCR檢測；B:P_780轉基因植株PCR檢測；C:P_320轉基因植株PCR檢測。
[0033]圖6.TPS2啟動子p-780片段與花香基因HcTPSl融合表達的轉基因菸草植株的PCR檢測圖；A:轉基因菸草用HcTPS2啟動子特異引物擴增；B:轉基因菸草用潮黴素引物特異引物擴增；C:轉基因菸草用HcTPSl基因特異引物擴增。
【具體實施方式】
[0034]下面結合附圖和具體實施例進一步詳細說明本發明。除非特別說明，實施例中採用的試劑和方法均為本領域常規使用的試劑和方法。
[0035]實施例1
[0036]TPS2啟動子序列的獲得
[0037]S1.姜花葉片總DNA的提取:將經液氮研磨的0.1~0.2g姜花植物葉片粉末轉移至1.5mL離心管中。加入ImLCTAB溶液，65°C水浴30分鐘；每隔10分鐘，顛倒一次。然後，向離心管中加入ImL酚:氯仿(I: I)，顛倒幾次，1000Orpm離心10分鐘，轉移上清至一新的離心管，加等體積的氯仿:異戊醇(24: I)，混勻，1000Orpm離心10分鐘。轉移上清至一新的離心管。加等體積的異丙醇，顛倒混勻，1000Orpm離心10分鐘，除去上清，70%乙醇洗一次，真空抽乾，溶於30yL的無菌水中，用於PCR擴增。所述CTAB溶液的組成為:TrislOOmM, NaCll.4M, 20mMEDTA, CTAB2%，巰基乙醇 0.1%。
[0038]S2.採用hiTAIL-PCR技術克隆HcTPS2基因的5'端上遊調控序列:根據發明人之前獲得的姜花HcTPS2 基因的序列(見 Li 和 Fan, 2011，Molecular Cloning and ExpressionAnalysis of a Terpene Synthase Gene, HcTPS2, in Hedychium coronarium.PlantMolecular Biology Reporter29 (I): 35-42),在其5'端設計3個向外的特異性巢式引物spl、sp2、sp3,隨機簡併引物設計參照Liu等(2007)文獻中設計的5個隨機簡併引物(Liu,2007, BioTechniques,43 (5):649_656)。具體序列如下:
[0039]spl:5』-CGGATATCATGGGAGCACAGATAGTAGTGC-3』 (SEQID NO:6)
[0040]sp2:5』-CTACACGATCACTACTTTGGAGCCTTGTCCTTC-3』 (SEQID NO:7)
[0041]sp3:5』-ATGAGGTCAGAGTTGTCGTGTGGATTTGGGCGTAG-3』 (SEQIDN0:8)
[0042]LAD-1:5』-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVNVNNNGGAA-3，(SEQIDN0:9)
[0043]LAD-2:5』-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBNBNNNGGTT-3』 (SEQIDN0:10)
[0044]LAD-3: 5，-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCWNVNNNCCAA-3，( SEQIDN0:11)
[0045]LAD-4:5』-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBDNBNNNCGGT-3』 (SEQIDN0:12)
[0046]ACl:5，-ACGATGGACTCCAGAG-3』 (SEQIDN0:13)
[0047]擴增的體系和程序參照Liu等(2007)文獻中的進行。把擴增出DNA片段從瓊脂糖膠中回收並連接到pMD-lOTvector，轉化E.col1.DH5 α，酶切鑑定後測序。測序序列如SEQIDN0:1所示；SEQIDN0:1所示序列包括啟動子TPS2序列和起始密碼子之後的基因的部分ORF序列。起始密碼子之前的序列就是啟動子TPS2的核苷酸序列，序列長1922bp，如SEQIDN0:2 所示。
[0048]將啟動子TPS2的核苷酸序列(SEQIDN0:2所示)提交在線啟動子分析軟體，預測啟動子中包含的順式調控元件，結果發現:啟動子TPS2的核苷酸序列分成3個5'端系列缺失的目的片段;3個5'端缺失序列分別為p-320、p-780和p-1928。p-320長度約為320bp(SEQIDNO: 3 所示);p-780 約 78Ibp (SEQIDN0:4 所示);p_1928 約 192Ibp (SEQIDN0:5 所示)。
[0049]TPS2啟動子調控元件分析
【權利要求】
1.一種姜花花部特異和傷害、蟲害誘導的TPS2啟動子，其特徵在於，核苷酸序列如SEQID NO:2 所示。
2.根據權利要求1所述TPS2啟動子，其特徵在於，所述TPS2啟動子含有3個5'端系列缺失的目的片段p-320、p-780和p-1928，p_320、p-780和p-1928的序列如SEQ IDNO:3~5所示。
3.—種重組載體，其特徵在於，所述重組載體為在出發載體的多克隆位點插入權利要求I所述TPS2啟動子序列。
4.一種重組載體，其特徵在於，所述重組載體為在出發載體的多克隆位點插入權利要求2所述TPS2啟動子的5'端系列缺失的目的片段p-320、p-780或p-1928序列。
5.一種包含權利要求3或4所述重組載體的重組菌。
6.一種包含權利要求3或4所述重組載體的細胞系。
7.權利要求1所述TPS2啟動子在培育轉基因花香或抗性植物品種中的應用。
8.一種培育轉基因花香或抗性植物的方法，其特徵在於，將含有權利要求3或4所述的重組載體導入出發植物細胞，從而得到TPS2啟動子啟動目的基因表達的轉基因花香或抗性植物。
9.根據權利要求8所述 方法，其特徵在於:所述目的基因為GUS基因。
【文檔編號】C12N15/113GK103525816SQ201310370871
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年8月22日 優先權日:2013年8月22日
【發明者】範燕萍, 李昕悅, 餘讓才, 吳永瓊, 嶽躍衝, 玉雲禕 申請人:華南農業大學