一對特異識別綿羊krt25基因的多肽及其編碼基因和應用的製作方法
2023-05-28 09:26:16 1
一對特異識別綿羊krt25基因的多肽及其編碼基因和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一對特異識別綿羊KRT25基因的多肽及其編碼基因和應用。該多肽由多肽甲和多肽乙組成；所述多肽甲由16個TAL核酸識別單元組成，每個TAL核酸識別單元中具有一個雙連胺基酸；所述多肽乙由15個TAL核酸識別單元組成，每個TAL核酸識別單元中具有一個雙連胺基酸。本發明可實現在細胞或個體水平上對綿羊KRT25基因進行敲除或修飾，以解析綿羊KRT25基因的功能、構建綿羊KRT25基因突變庫或獲得相關疾病模型，為綿羊育種及醫藥研發服務。
【專利說明】-對特異識別綿羊KRT25基因的多肽及其編碼基因和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬於基因工程【技術領域】，涉及一對特異識別綿羊KRT25基因的多肽及其編 碼基因和應用。
【背景技術】
[0002] 角蛋白是毛囊和皮膚生物學功能重要的決定因子之一，在一定程度上決定羊毛的 品質和產量。內根鞘角蛋白基因一般分為酸性的I型角蛋白基因（KRT25, KRT26, KRT27， KRT28)和呈中性或鹼性的II型角蛋白基因（KRT71，KRT72, KRT73, KRT74)，它們都在毛囊 內根鞘特異性表達。所編碼的蛋白質參與毛囊的形態發生過程。R〇gers(2004)研究證明 I 型內根鞘角蛋白基因 （Rogers GE. Hair follicle differentiation and regulation. International Journal of Developmental Biology, 2004, 48:163-170)在羊的內根鞘中 特異性表達。由此可見，KRT25基因可作為綿羊抗病育種及羊毛細度育種的一個重要候選 基因。在細胞或個體水平上對綿羊KRT25基因進行敲除或修飾，可解析綿羊KRT25基因的 功能，為綿羊育種及醫藥研發服務。
[0003] 轉錄激活子樣效應因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs)技術是一個高效的基因打靶新工具。轉錄因子激活效應物家族中有一 種蛋白（TALEs)能夠識別、結合DNA。TALE與DNA序列特異性結合主要是由TAL結構內34 個恆定胺基酸序列介導。將TALEs與FokI核酸內切酶的切割域相連接，形成TALENs，從而 可以實現對基因組DNA序列的精確修飾。TALENs是一種異源二聚體分子（兩單位的TALE DNA結合結構域融合到一單位的催化性結構域），能夠切割兩個相隔較近的序列，從而使得 特異性增強。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一對特異識別綿羊KRT25基因的多肽及其編碼基因和應用。 本發明利用這對多肽構建獲得的一對重組的轉錄激活子樣效應因子（TALE)能夠特異性地 識別綿羊KRT25基因。本發明還利用這對轉錄激活子樣效應因子構建獲得的一對轉錄激活 子樣效應因子核酸酶（TALENs)，能夠對綿羊KRT25基因進行準確、高效地靶向修飾。
[0005] 具體地，本發明的目的是這樣實現的：
[0006] -對特異識別綿羊KRT25基因的多肽（命名為特異多肽對），由多肽甲和多肽乙組 成；所述多肽甲由16個TAL核酸識別單元組成，每個TAL核酸識別單元中具有一個雙連氨 基酸；所述多肽乙由15個TAL核酸識別單元組成，每個TAL核酸識別單元中具有一個雙連 胺基酸；
[0007] 所述多肽甲中的16個雙連胺基酸依次如下：序列表的序列3自N末端第12-13位 胺基酸殘基、第46-47位胺基酸殘基、第80-81位胺基酸殘基、第114-115位胺基酸殘基、第 148-149位胺基酸殘基、第182-183位胺基酸殘基、第216-217位胺基酸殘基、第250-251 位胺基酸殘基、第284-285位胺基酸殘基、第318-319位胺基酸殘基、第352-353位胺基酸 殘基、第386-387位胺基酸殘基、第420-421位胺基酸殘基、第454-455位胺基酸殘基、第 488-489位胺基酸殘基和第522-523位胺基酸殘基。
[0008] 所述多肽乙中的15個雙連胺基酸依次如下：序列表的序列4自N末端第12-13位 胺基酸殘基、第46-47位胺基酸殘基、第80-81位胺基酸殘基、第114-115位胺基酸殘基、第 148-149位胺基酸殘基、第182-183位胺基酸殘基、第216-217位胺基酸殘基、第250-251 位胺基酸殘基、第284-285位胺基酸殘基、第318-319位胺基酸殘基、第352-353位胺基酸 殘基、第386-387位胺基酸殘基、第420-421位胺基酸殘基、第454-455位胺基酸殘基和第 488-489位胺基酸殘基。
[0009] 所述多肽甲具體可如序列表的序列2所示。
[0010] 所述多肽乙具體可如序列表的序列4所示。
[0011] 本發明還保護一對DNA分子（命名為特異DNA分子對），由編碼所述多肽甲的DNA 分子甲和編碼所述多肽乙的DNA分子乙組成。
[0012] 所述DNA分子甲中，編碼所述多肽甲的16個雙連胺基酸的核苷酸依次如下：序列 表的序列4自5'末端第34-39位核苷酸、第136-141位核苷酸、第238-243位核苷酸、第 340-345位核苷酸、第442-447位核苷酸、第544-549位核苷酸、第646-651位核苷酸、第 748-753位核苷酸、第850-855位核苷酸、第952-957位核苷酸、第1054-1059位核苷酸、第 1156-1161位核苷酸、第1258-1263位核苷酸、第1360-1365位核苷酸、第1462-1467位核苷 酸和第1564-1569位核苷酸。
[0013] 所述DNA分子乙中，編碼所述多肽乙的15個雙連胺基酸的核苷酸依次如下：序列 表的序列4自5'末端第34-39位核苷酸、第136-141位核苷酸、第238-243位核苷酸、第 340-345位核苷酸、第442-447位核苷酸、第544-549位核苷酸、第646-651位核苷酸、第 748-753位核苷酸、第850-855位核苷酸、第952-957位核苷酸、第1054-1059位核苷酸、第 1156-1161位核苷酸、第1258-1263位核苷酸、第1360-1365位核苷酸和第1462-1467位核 苷酸。
[0014] 所述DNA分子甲具體可如序列表的序列1所示。
[0015] 所述DNA分子乙具體可如序列表的序列3所示。
[0016] 本發明還保護所述特異多肽對在特異識別和靶向修飾綿羊KRT25基因中的應用。 所述綿羊KRT25基因，其NCBI GI為57619200。
[0017] 本發明還保護所述特異多肽對在構建綿羊KRT25基因突變庫中的應用。所述綿羊 KRT25 基因，其 NCBI GI 為 57619200。
[0018] 與現有技術相比，本發明提供了特異識別綿羊KRT25基因的多肽對，並提供了該 多肽對的編碼基因。本發明可實現在細胞或個體水平上對綿羊KRT25基因進行敲除或修 飾，以解析綿羊KRT25基因的功能、構建綿羊KRT25基因突變庫或獲得相關疾病模型，為綿 羊育種及醫藥研發服務。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019] 圖1為TALENs祀點設計結果示意圖。
[0020] 圖2為TALEN質粒對（左臂TALEN和右臂TALEN)轉染綿羊SEF細胞72小時後提 取DNA進行PCR擴增，將PCR產物克隆後的部分測序結果（突變序列）。
[0021] 圖3為TALEN質粒對的工作原理示意圖。
【具體實施方式】
[0022] 以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，結果取平 均值。以下實施例中，如無特殊說明，均採用低糖DMEM培養基培養細胞。
[0023] FastTALE? TALEN快速構建試劑盒：上海斯丹賽生物技術有限公司，Cat No. 1802-030。該試劑盒包含兩個模塊板：模塊板1包含96個模塊，每個模塊識別連續的兩 個鹼基；模塊板2包含76個模塊，其中48個模塊識別連續的兩個鹼基，28個模塊識別單個 鹼基。另外，該試劑盒還包括其他組分：溶液1、溶液2、溶液3、溶液4、溶液5、感受態細胞、 S0C培養基、ddH20 ;TALEN骨架載體，包括左臂骨架和右臂骨架。
[0024] 實施例1、TALENs質粒對的構建
[0025] 1、TALENs 靶點設計
[0026] 米用在線軟體(https://tale-nt. cac. Cornell, edu)設計。將綿羊 KRT25 基 因 cDNA序列（NCBI GI為57619200)輸入軟體中，在130-177bp區域找到靶序列，具體示 意圖如圖1所示。TALENs左臂識別序列是5 ' -TGCAGCATGCCTGGAA-3 '，右臂識別序列是 5, -GCTCCCAAAGGCACA-3，。
[0027] 2、TALENs 模塊組裝
[0028] 依照FastTALE? TALEN快速構建試劑盒（以下簡稱"試劑盒"）說明書進行。具體 步驟如下：
[0029] 1)將左右臂識別序列分別拆分為9個模塊，以一個或兩個鹼基組合為一個模塊， 依次進行標記，如首個標記為1，最後一個標記為9,如下所示：
[0030] 左臂 L5:T1 GC2 A3 GC4 AT5 GC6 CT7 GG8 AA9(使用骨架載體 L15)
[0031] 右臂 R5:G1 C2 TC3 CC4 AA5 AG6 GC7 CA8 CA9(使用骨架載體 R11)
[0032] 2)從試劑盒中取出相應編號的9個模塊，每個模塊取1. 5微升，並將其加入同一個 PCR管中。
[0033] 3)將溶液1、溶液2從-20°C冰箱取出置於冰盒上，溶液3放置於37°C水浴鍋中溶 解。
[0034] 4)按如下體系加樣，先加入相應的TALEN骨架載體（L16或R12)，然後將溶液3、溶 液1、溶液2依次加入步驟2的PCR管中，最後加水補至20微升，短暫離心混勻。
[0035] 連接體系：
[0036]
【權利要求】
1. 一對特異識別綿羊KRT25基因的多肽，由多肽甲和多肽乙組成；所述多肽甲由16個 TAL核酸識別單元組成，每個TAL核酸識別單元中具有一個雙連胺基酸；所述多肽乙由15 個TAL核酸識別單元組成，每個TAL核酸識別單元中具有一個雙連胺基酸； 所述多肽甲中的16個雙連胺基酸依次如下：序列表的序列2自N末端第12-13位氨 基酸殘基、第46-47位胺基酸殘基、第80-81位胺基酸殘基、第114-115位胺基酸殘基、第 148-149位胺基酸殘基、第182-183位胺基酸殘基、第216-217位胺基酸殘基、第250-251 位胺基酸殘基、第284-285位胺基酸殘基、第318-319位胺基酸殘基、第352-353位胺基酸 殘基、第386-387位胺基酸殘基、第420-421位胺基酸殘基、第454-455位胺基酸殘基、第 488-489位胺基酸殘基和第522-523位胺基酸殘基； 所述多肽乙中的15個雙連胺基酸依次如下：序列表的序列4自N末端第12-13位氨 基酸殘基、第46-47位胺基酸殘基、第80-81位胺基酸殘基、第114-115位胺基酸殘基、第 148-149位胺基酸殘基、第182-183位胺基酸殘基、第216-217位胺基酸殘基、第250-251 位胺基酸殘基、第284-285位胺基酸殘基、第318-319位胺基酸殘基、第352-353位胺基酸 殘基、第386-387位胺基酸殘基、第420-421位胺基酸殘基、第454-455位胺基酸殘基和第 488-489位胺基酸殘基。
2. 如權利要求1所述的一對特異識別綿羊KRT25基因的多肽，其特徵在於：所述多肽 甲的胺基酸序列如序列表中的序列2所示；所述多肽乙的胺基酸序列如序列表中的序列4 所示。
3. -對DNA分子，由編碼權利要求1中的所述多肽甲的DNA分子甲和編碼權利要求1 中的所述多肽乙的DNA分子乙組成。
4. 如權利要求3所述的一對DNA分子，其特徵在於： 所述DNA分子甲中，編碼所述多肽甲的16個雙連胺基酸的核苷酸依次如下：序列表的 序列4自5'末端第34-39位核苷酸、第136-141位核苷酸、第238-243位核苷酸、第340-345 位核苷酸、第442-447位核苷酸、第544-549位核苷酸、第646-651位核苷酸、第748-753位 核苷酸、第850-855位核苷酸、第952-957位核苷酸、第1054-1059位核苷酸、第1156-1161 位核苷酸、第1258-1263位核苷酸、第1360-1365位核苷酸、第1462-1467位核苷酸和第 1564-1569位核苷酸； 所述DNA分子乙中，編碼所述多肽乙的15個雙連胺基酸的核苷酸依次如下：序列表的 序列4自5'末端第34-39位核苷酸、第136-141位核苷酸、第238-243位核苷酸、第340-345 位核苷酸、第442-447位核苷酸、第544-549位核苷酸、第646-651位核苷酸、第748-753位 核苷酸、第850-855位核苷酸、第952-957位核苷酸、第1054-1059位核苷酸、第1156-1161 位核苷酸、第1258-1263位核苷酸、第1360-1365位核苷酸和第1462-1467位核苷酸。
5. 如權利要求4所述的一對DNA分子，其特徵在於：所述DNA分子甲的核苷酸序列如 序列表中的序列1所示，所述DNA分子乙的核苷酸序列如序列表中的序列3所示。
6. 權利要求1所述的一對多肽在特異識別和靶向修飾綿羊KRT25基因中的應用。
7. 權利要求1所述的一對多肽在構建綿羊KRT25基因突變庫中的應用。
【文檔編號】C07K14/47GK104250297SQ201410471728
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2014年9月15日 優先權日:2014年9月15日
【發明者】柳楠, 李和剛, 趙金山, 劉積鳳, 劉開東, 程明, 賀建寧 申請人:青島農業大學