一種基於雙振鏡雙物鏡多模式寬場超分辨顯微成像系統的製作方法

2023-05-28 05:22:31

本發明屬於光學超分辨顯微成像領域，特別涉及一種基於雙振鏡雙物鏡多模式寬場超分辨顯微成像系統。

背景技術：

超分辨螢光顯微成像技術的出現為現代生物醫學研究提供了新的強有力的工具，將螢光顯微鏡的應用推到了新的高度。與其它研究方法，如核磁共振、電子顯微鏡、ct等相比，光學超分辨顯微鏡具有獨一無二的優勢，如成像無需進行特殊組織製備；使用螢光探針標記可以特異性地研究某物質的結構和功能；可以很方便的通過多色多通道同時觀測多個蛋白分子；可以進行活體成像，獲取較大區域內的樣品信息；可以對生物組織進行三維成像等。因此，光學超分辨螢光顯微成像技術在過去的幾十年裡已經發展的較為成熟。2014年諾貝爾化學獎授予了ericbetzig、stefanhell以及williammoerner三位科學家，以表彰他們在「超分辨螢光顯微鏡」領域的貢獻。

由於光學衍射極限的存在，一個理想點物經過成像系統之後會變成一個有限大小的彌散斑，其橫向強度分布可以用貝塞爾函數來描述，軸向強度分布用辛格函數來描述，且軸向解析度比橫向解析度要差三倍左右。有多種超螢光顯微成像技術可以突破橫向或軸向衍射極限，實現超分辨。如：結構光照明顯微成像技術使用兩束光在待測樣品表面相互幹渉產生條紋圖樣，調製樣品的空間頻率，將高頻信息移動到可觀測到的低頻範圍內，從而將橫向解析度提高了兩倍；駐波幹涉顯微成像技術在樣品兩側使用兩個對稱放置的物鏡，兩束垂直入射光在樣品軸向方向發生幹涉，從而使得軸向的高頻信息可被觀測到，在軸向實現了超分辨；全內反射顯微成像技術使用大數值孔徑物鏡使得入射光在樣品表面發生全反射，在很小的軸向範圍內通過倏逝波激發螢光，在軸向實現了層析和超分辨。

技術實現要素：

本發明提供了一種基於雙振鏡雙物鏡多模式寬場超分辨顯微成像系統，利用雙振鏡加雙物鏡結構，該裝置可以同時實現駐波幹涉、結構光照明和多角度環狀全內反射寬場超分辨顯微成像，可以滿足使用者在不同條件下的需求，特別適用於對螢光樣品進行成像。

一種基於雙振鏡雙物鏡多模式寬場超分辨顯微成像系統，包括：激發光路模塊和成像光路模塊。其中激發光路模塊包括雷射器、分束鏡、兩套4f掃描振鏡系統、兩個顯微物鏡和待測螢光樣品；成像光路模塊包括兩個顯微物鏡、兩個二向色鏡和兩個工業相機。

所述激發光路模塊用於將入射雷射分為兩路，從樣品上下表面入射。

所述雷射器與分束鏡之間依次放置有單模光纖和起偏器。所述雷射器用於產生入射光。所述單模光纖用於對雷射器產生的光束進行濾波。所述起偏器用於將雷射器產生的光束變為線偏振光。

所述激發光路分束鏡用於將入射光分為兩路，依次各自經過掃描振鏡系統，進入顯微物鏡後瞳面，激發待測樣品發出螢光。其中一路光直接進入掃描振鏡系統中，另一路光經平面反射鏡反射後再進入掃描振鏡系統，平面鏡用於改變光路傳播方向，同時通過壓電陶瓷驅動在結構光照明成像模式中對結構光圖樣進行相移。兩路光的光程需要滿足幹涉條件，以便能夠進行駐波幹涉和結構光照明成像兩種模式。

所述兩套掃描振鏡系統都採用透射式4f透鏡結構，用於控制顯微物鏡後瞳面處的光束入射角在0°、小於全反射臨界角和大於全反射臨界角範圍內切換，從而實現駐波幹涉、結構光照明和多角度環狀全內反射等多種寬場超分辨顯微成像模式的切換，同時在結構光照明和全內反射顯微成像模式中分別通過振鏡控制光束掃描實現結構光照明圖樣方向的旋轉和多角度環狀全內反射。所述兩套透射式4f掃描振鏡系統也可採用反射式，其焦面位置處各放置有一個切向光偏振轉換器，用於將入射線偏振光轉換到切向偏振方向，始終保持結構光圖樣的對比度最高。

所述兩套掃描振鏡系統和待測螢光樣品之間依次各自放置有掃描透鏡和顯微物鏡。所述兩個掃描透鏡焦面與對應顯微物鏡入瞳面重合，對像面進行轉移。所述兩個顯微物鏡均為全內反射式物鏡，na＝1.49，用於將兩束切向線偏振光聚焦到待測樣品表面激發螢光。

所述成像光路模塊用於收集待測樣品發出的兩路螢光信號，利用計算機進行數據處理和圖像重構。

所述兩個顯微物鏡分別放置在待測樣品上下表面附近，用於收集待測樣品發出的螢光信息。所述兩個二向色鏡用於透射入射光、反射螢光。

所述兩個二向色鏡和兩個工業相機之間依次各放置一個濾波片和匯聚透鏡。所述兩個濾波片用於濾去待測樣品發出的螢光信號中的雜散光。所述兩個匯聚透鏡焦平面與對應顯微物鏡入瞳面重合，用於將待測樣品發出的螢光信號成像到對應的工業相機上。

所述兩個工業相機得到的樣品信息需要利用計算機通過相應算法進行數據處理和重構，以得到相應成像模式下的超分辨圖像。

本發明原理如下：

駐波幹涉顯微成像技術和結構光照明顯微成像技術的原理十分相似，都是使用兩束光進行幹涉，得到的正弦幹涉條紋由於存在兩個高頻分量，會對樣品進行調製，將通常無法被成像系統接受的高頻信息轉移到低頻範圍內，從而獲得了更多的樣品信息，提高了系統解析度。兩者的主要區別是駐波幹涉顯微成像技術中兩束光垂直相向入射，在樣品軸向方向發生幹涉，所以調製的高頻信息中大部分都是軸向高頻信息；而結構光照明顯微成像技術中兩束光以一定角度斜入射，在樣品橫向方向發生幹涉，主要提高了橫向解析度。鑑於兩種超分辨顯微成像原理相似，所以有可能將其集成到一套系統中，方便用戶在不同條件下的使用。

另一方面，全內反射顯微成像技術是以大於全反射臨界角入射，在樣品表面發生全反射產生倏逝波激發待測樣品發出螢光信號，考慮到全內反射成像最主要的需求是大數值孔徑物鏡，因此有可能通過駐波幹涉顯微成像系統實現。

本發明以駐波幹涉顯微成像系統為基礎，使用兩個大數值孔徑物鏡以儘可能多的獲取樣品發出的螢光信號，大數值孔徑物鏡也確保了全內反射可以實現。同時在兩路入射光路各加入一套掃描振鏡系統，通過計算機控制振鏡掃描改變入射光到達兩個顯微物鏡後瞳面的角度和位置，進而控制樣品上的光束入射角，使其在垂直入射、小於全反射臨界角入射和大於全反射臨界角入射範圍內切換，從而選擇不同的成像模式。

駐波幹涉顯微成像模式下，控制振鏡使得兩束激發光從相反方向垂直入射樣品，在樣品軸向方向發生幹涉，產生的螢光信號也分為兩路收集，各自成像在一個工業相機上。對得到的圖像進行處理獲取駐波幹涉超分辨結果。

結構光照明顯微成像模式下，控制振鏡使得兩束激發光從待測樣品兩側以小於全反射臨界角入射，在樣品同一橫向位置處發生幹涉。再通過壓電陶瓷控制反射鏡發生位移調節光程差，得到相移結構光照明圖樣。然後通過計算機控制振鏡系統進行掃描，得到不同方向的結構光照明圖樣。對得到的多幅樣品圖像進行數據處理可以重構得到超高解析度的螢光圖像。

多角度環狀全內反射顯微成像模式下，控制振鏡使得兩束激發光從待測樣品兩側以大於全反射臨界角入射，分別在樣品兩側以倏逝波激發螢光信號，各自進入相應的工業相機，實現不同表面位置的軸向超分辨。若樣品足夠薄，雙側同時全內反射成像即相當於獲取了樣品的三維信息。同時控制振鏡系統使得入射光在樣品表面以全內反射模式進行環狀掃描，即可得到多方位角度全內反射圖像，相比單角度全內反射光場更均一，圖像質量更好。

與現有技術相比，本發明無需替換任何元件，在一套系統中集成了駐波幹涉、結構光照明和多角度環狀全內反射等多種寬場超分辨顯微成像模式，可以滿足用戶大部分條件下的使用需求，大大節省了成本，對光學超分辨顯微成像技術的發展和實用化具有重要意義和重大價值。

附圖說明

圖1為基於雙振鏡雙物鏡多模式寬場超分辨顯微成像系統示意圖。

圖2(a)為駐波幹涉寬場超分辨顯微成像模式下圖1虛線框部分入射光角度示意圖；圖2(b)為駐波幹涉在樣品軸向產生的條紋示意圖。

圖3(a)為結構光照明寬場超分辨顯微成像模式下圖1虛線框部分入射光角度示意圖；圖3(b)為結構光照明在樣品橫向產生的某方向條紋示意圖。

圖4為多角度環狀全內反射寬場超分辨顯微成像模式下圖1虛線框部分入射光角度示意圖。

具體實施方式

下面結合實施例和附圖來詳細說明本發明，但本發明並不僅限於此。

如圖1所示的基於雙振鏡雙物鏡多模式寬場超分辨顯微成像系統，包括：雷射器1、單模光纖2、起偏器3、分束鏡4、平面反射鏡5、壓電陶瓷6、第一振鏡7、第一凸透鏡8、第一切向光偏振轉換器9、第二凸透鏡10、第二振鏡11、第一掃描透鏡12、第一顯微物鏡13、第三振鏡14、第三凸透鏡15、第二切向光偏振轉換器16、第四凸透鏡17、第四振鏡18、第二掃描透鏡19、第二顯微物鏡20、待測樣品21、第一二向色鏡22、第一濾波片23、第一匯聚透鏡24、第一工業相機25、第二二向色鏡26、第二濾波片27、第二匯聚透鏡28、第二工業相機29和計算機30。

雷射器1發出雷射光束，單模光纖2、起偏器3、分束鏡4和平面反射鏡5依次放置在入射光路的光軸上。單模光纖2用於對雷射光束進行濾波。起偏器3用於將出射光轉換成線偏振光。分束鏡4用於將入射光分成兩路。平面反射鏡5用於改變入射光傳播方向，同時連接有壓電陶瓷6，在結構光照明顯微成像模式下，壓電陶瓷6用於驅動平面反射鏡5進行位移改變兩路光的光程差從而使得結構光圖樣發生相移。

兩路入射光分別進入由第一振鏡7、第一凸透鏡8、第二凸透鏡10和第二振鏡11構成的第一套掃描振鏡系統以及由第三振鏡14、第三凸透鏡15、第四凸透鏡17和第四振鏡18構成的第二套掃描振鏡系統。通過計算機30控制第一振鏡7和第三振鏡14進行x方向掃描，第二振鏡11和第四振鏡18進行y方向掃描，實現兩路入射光的圓掃描，同時可以改變入射光角度以切換到不同成像模式。兩套掃描振鏡系統中的兩個振鏡由兩個凸透鏡構成的4f系統連接，採用4f系統可以減小掃描誤差，提高成像質量。兩個4f系統的焦平面處分別放置有第一切向光偏振轉換器9和第二切向光偏振轉換器16，用於將入射光轉換成兩束切向偏振的線偏振光，保證結構光照明成像模式下結構光照明圖樣條紋對比度最高。

從兩套振鏡掃描系統出來的兩束切向線偏振光各自依次經過共軸放置的第一掃描透鏡12、和第一顯微物鏡13以及第二掃描透鏡19和第二顯微物鏡20，入射到待測螢光樣品21上。第一掃描透鏡12和第二掃描透鏡19的焦平面分別與第二凸透鏡10和第四凸透鏡17的焦平面重合，另一側焦平面與第一顯微物鏡13和第二顯微物鏡20的入瞳面重合，用於轉移物像關係，提高振鏡掃描邊緣光束入射到物鏡入瞳面的能力。第一顯微物鏡13和第二顯微物鏡20均為全內反射式物鏡，na＝1.49，用於將兩束切向線偏振光聚焦到待測樣品21表面激發螢光，從兩物鏡出來的激發光束入射到待測樣品21上的角度決定了此時為何種顯微成像模式，如圖2、3和4所示。

兩路入射光激發待測樣品21產生的兩路螢光信號又分別依次通過第一顯微物鏡13、第一二向色鏡22和第二顯微物鏡20、第二二向色鏡26進入兩路探測光路。第一顯微物鏡13和第二顯微物鏡20位於待測樣品21上下表面附近，用於收集樣品發出的螢光信號。第一二向色鏡22和第二二向色鏡26用於透射入射光、反射螢光。

進入兩路探測光路的螢光信號依次各自經過共軸放置的第一濾波片23、第一匯聚透鏡24和第二濾波片27、第二匯聚透鏡28，進入對應的第一工業相機25和第二工業相機29。第一濾波片23和第二濾波片27用於濾去待測樣品21發出的螢光信號中的雜散光。第一匯聚透鏡24和第二匯聚透鏡28用於將兩路螢光信號分別聚焦到第一工業相機25和第二工業相機29上。

計算機30用於控制兩套振鏡系統進行掃描，改變入射到樣品上的入射光線角度，從而實現駐波幹涉、結構光照明和多角度環狀全內反射等多種寬場超分辨顯微成像模式的切換。同時對各種成像模式得到的原始數據和圖像通過相應的算法進行重構處理，獲取相應模式下的寬場超分辨螢光圖像。

以上所述僅為本發明的較佳實施舉例，並不用於限制本發明，凡在本發明精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。