一種補體抑制劑的製作方法

2023-06-26 19:52:06

專利名稱：一種補體抑制劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種補體抑制劑，更具體地說，本發明涉及一種以有效量的化合物升麻內酯A為活性成分並配於藥學上可接受的載體組成的補體抑制製劑。
背景技術：
自從1889年Buchner報告以單一血清成分提出防禦素(alexine，即現在所說的補體)以來，經過一個多世紀的研究，已經清楚補體是由13個固有成分、近20種調節因子及10餘種補體受體共同組成的一個適應性防禦系統。同時補體包括許多與補體功能相關的分子。所有補體成分都是蛋白質，其組成的眾多成分的結構和功能的研究，以及對補體相關學科及臨床實踐關係的研究，構成了相對獨立的分支學科，即「補體學」(Complementology)。Bordet實驗證實各種動物紅血細胞抗體加入補體可以引起免疫溶血現象。由於對漏出的血紅蛋白可以進行定量測定，建立了羊紅細胞的免疫溶血系統E(紅細胞)、A(抗羊紅細胞抗體)及C(補體)，為補體功能的研究提供了優良的實驗模型。他還進一步發現，將免疫血清預先與其他抗原抗體系統相作用，則血清可喪失溶血活性，從而建立了體外補體結合試驗，在此研究基礎上形成了補體(complemetary)的概念，即補體為血清的單一成分，補體的溶菌、溶細胞作用有賴於抗體的存在，任何系統的抗原抗體複合物均具有固定補體的作用。根據英中醫學詞海解釋補體原指血清中引起免疫性細胞溶解(抗體包裹細胞溶解)的不耐熱因子，現指至少由20種截然不同的血清蛋白組成的完整功能系統，該系統不僅是細胞性溶解的效應物，而且也是生物功能的效應物。補體激活有經典和替代兩種途徑。經典途徑的蛋白質稱為「補體成分」，以縮寫符號C1至C9表示。C1是三種不同的蛋白(C1q，C1r，C1s)的鈣依賴性複合物。替代途徑(旁路)的蛋白質(統稱為裂解素系統)和補體調節蛋白，則以其半系統名或俗名為眾人所熟悉。補體裂解產生的片段，用小寫的字母後綴表示(C3a)。未激活的片段用後綴「i」表示，如C3bi。激活的具有生物活性的補體成分或複合物，則在符號前加一橫線，如C1-，C4b，2a-。經典途徑通過C1與單個IgM分子或相鄰的兩個IgG分子相結合。替代途徑可以被IgA免疫複合物激活，也可以為非免疫物質，包括細菌內毒素、微生物的多糖類和細胞壁激活。經典途徑的激活可以產生觸發酶系列，涉及C1，C4，C2和C3而替代途徑的激活則可觸發C3和B、D、P因子的酶系列。二條途徑最後都使C5裂解和形成膜攻擊複合物。補體激活同時還形成許多具有生物學活性的補體片段，起過敏毒素，調理素或趨化因子的作用。生物學活性補體產物、補體系統酶和活性複合物的描述如下表CR＝CC40.CR。
升麻是我國十分常用的著名中藥，主要為毛茛科植物三葉升麻Cimicifugaheracleifolia Kom、興安升麻C.dahurica Maxim、升麻或綠升麻C.foetida L.的乾燥根莖。升麻具有發表透疹，清熱解毒，升舉陽氣的功效；常被用於風熱頭痛，齒痛，口瘡，咽喉腫痛，麻疹不透，陽毒發斑，脫肛，子宮脫垂等病症。升麻Cimicifuga foetida L.主要產於雲南、貴州、四川、湖北等地，是大量栽培的常用中藥材。升麻是我國十分常用的著名中藥，主要為毛茛科植物三葉升麻Cimicifuga heracleifo Kom、興安升麻C.dahurica Maxim、升麻或綠升麻C.foetida L.的乾燥根莖。升麻具有發表透疹，清熱解毒，升舉陽氣的功效；常被用於風熱頭痛，齒痛，口瘡，咽喉腫痛，麻疹不透，陽毒發斑，脫肛，子宮脫垂等病症。升麻Cimicifuga foetida L.主要產於雲南、貴州、四川、湖北等地，是大量栽培的常用中藥材。現有技術中尚未有化合物升麻內酯A作為補體生物活性的報導。

發明內容
本發明的目的在於提供一種以有效量的化合物升麻內酯A化合物為活性成分並配於藥學上可接受的載體組成的補體抑制劑，以及該補體抑制劑的製備方法。
本發明的目的通過下述技術方案予以實現一種補體抑制劑，其中含有有效量的化合物升麻內酯A和藥學上可接受的載體。
補體抑制劑的製備方法先取升麻Cimicifuga ssp.的根莖，粉碎後用甲醇提取三次，每次約3-4小時，甲醇提取液過濾除去藥渣後，減壓濃縮至蒸不出甲醇，再加一定量的水稀釋，用石油醚萃取2-3次，回收石油醚後，濃縮得到石油醚提取部位，然後水層再用乙酸乙酯萃取2-3次，回收乙酸乙酯，濃縮得到乙酸乙酯提取部位，用矽膠柱層析分離2-5次，洗脫液用氯仿∶甲醇(或氯仿/丙酮)梯度洗脫，洗脫得到化合物升麻內酯A，然後加入藥學上可接受的載體，得補體抑制製劑。
更具體的製備方法為取升麻Cimicifuga foetida L.的乾燥根莖，粉碎後用甲醇提取三次，每次4小時，甲醇提取液過濾除去藥渣後，減壓濃縮至蒸不出甲醇，再加一定量的水稀釋之後，用石油醚萃取三次，回收石油醚後，濃縮得到石油醚提取部位，然後水層再用乙酸乙酯萃取三次，回收乙酸乙酯，濃縮得到乙酸乙酯提取部位，乙酸乙酯提取部位用1000g矽膠柱層析分離，洗脫液用氯仿∶甲醇從100∶0；100∶1；50∶1；20∶1到1∶1梯度洗脫，由氯仿/甲醇20∶1洗脫液洗脫得到的部位Fr.4，該分離部位Fr.4用1000g矽膠柱層析再次分離，繼續用洗脫液用氯仿∶甲醇從40∶1；30∶1；20∶1梯度洗脫，由氯仿∶甲醇40∶1洗脫液洗脫得到的部分，濃縮後得到分離部位Fr.4.1，該分離部位Fr.4.1用450g矽膠柱層析再次分離，繼續用洗脫液用氯仿∶甲醇從50∶1；40∶1梯度洗脫，依次得到兩個化合物及分離部位Fr.4.1.1和分離部位Fr.4.1.2，分離部位Fr.4.1.2用150g矽膠柱層析再次分離，用氯仿∶甲醇40∶1洗脫得到化合物升麻內酯A，然後加入藥學上可接受的載體，得補體抑制劑。
本發明的化合物升麻內酯A用作藥物上時，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用，該藥物組合物含有0.1-99％，優選0.5-90％的升麻內酯A，其餘為藥物學上可接受的、對人和動物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
所述的藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、超填料以及藥物製品輔劑。將所述的有效部位以單位體重服用量的形式使用。本發明的藥物可經口服給藥。
口服可用其固體或液體製劑，如片劑、散劑、糖衣劑、膠囊、溶液、乳劑、糖漿、滴丸劑等。
具體實施例方式下面用本發明的實施例來進一步說明本發明的實質，但本發明的內容並不局限於此。
實施例11、升麻內酯A化合物(以下簡稱K-13)的提取分離及製備方法取升麻Cimicifuga foetida L.的乾燥根莖2.5Kg，粉碎後用甲醇提取三次，每次約4小時；甲醇提取液過濾除去藥渣後，減壓濃縮至蒸不出甲醇；再加一定量的水稀釋之後，用石油醚萃取三次，回收石油醚後，濃縮得到187g石油醚提取部位；然後水層再用乙酸乙酯萃取三次，回收乙酸乙酯，濃縮得到245g乙酸乙酯提取部位。245g乙酸乙酯提取部位用1000g矽膠柱層析分離，洗脫液用氯仿∶甲醇從100∶0；100∶1；50∶1；20∶1到1∶1梯度洗脫，由氯仿/甲醇20∶1洗脫液洗脫得到的部位Fr.4重約97g。該分離部位97g Fr.4用1000g矽膠柱層析再次分離，繼續用洗脫液用氯仿∶甲醇從40∶1；30∶1；20∶1梯度洗脫，由氯仿∶甲醇40∶1洗脫液洗脫得到的部分，濃縮後得到分離部位Fr.4.1重約21.6g。該分離部位21.6g Fr.4.1用450g矽膠柱層析再次分離，繼續用洗脫液用氯仿∶甲醇從50∶1；40∶1梯度洗脫，依次得到兩個化合物K-12，K-15，及分離部位Fr.4.1.1和分離部位Fr.4.1.2，分離部位Fr.4.1.2約重2.5g。該分離部位Fr.4.1.2用150g矽膠柱層析再次分離，用氯仿∶甲醇40∶1洗脫得到化合物K-13，重約17mg。
2、K-13化合物的結構確定K-13化合物C33H50O9，無色針狀晶體(甲醇)，mp 255-256℃，[α]D＝-36.7°(c 0.75，CHCl3-MeOH 1∶1)。
氫核磁共振譜數據δ(ppm)5.05(1H，dd，J＝9，3Hz，12-H)，4.78(1H，dd，J＝14，7.5Hz，16-H)，3.49(1H，dd，J＝11，4Hz，3-H)，2.69(1H，dd，J＝16.2，3.1Hz)1.15(1H，dd，J＝16.2，3.1Hz)(11-H)；2.45(1H，m)2.25(1H，m)(22-H)；2.26(1H，d，J＝10.8)1.83(1H，m)(2-H)，2.12(1H，d，J＝7.5Hz，17-H)，1.99(1H，m，20-H)，1.96(1H，m)1.80(1H，m)(15-H)，1.60(1H，dd，J＝11.5，5Hz，8-H)，1.49(1H，m)1.10(1H，m)(1-H)；1.46(1H，m)0.70(1H，m)(6-H)；1.25(3H，s，29-H)，1.23(1H，m，5-H)，1.24(1H，m)0.92(1H，m)(7-H)；1.23(3H，s，18-H)，1.00(3H，s，30-H)；0.95(3H，d，J＝6Hz，21-H)，0.83(3H，s，28-H)，0.56(1H，d，J＝3.4Hz)0.19(1H，d，J＝3.4Hz)(19-H)。COCH3部分2.12(3H，s，COCH3)。木糖部分4.84(1H，d，J＝7.5Hz，1』-H)，4.21(1H，m，4』-H)，4.15(1H，dd，J＝8.5，8.0Hz，3』-H)，4.03(1H，dd，J＝8.0，7.5Hz，2』-H)，3.73(2H，m，5』-H)。
碳核磁共振譜數據δ(ppm)174.0(s，23-C)，88.2(d，3-C)，80.6(d，16-C)，76.8(d，12-C)，53.7(d，17-C)，48.4(s，13-C)，47.0(s，14-C)，47.0(d，5-C)，46.0(d，8-C)，43.9(t，15-C)，38.7(t，22-C)，41.3(s，4-C)，36.5(t，11-C)，32.0(t，1-C)，30.0(t，19-C)，29.7(t，2-C)，27.0(s，10-C)，27.0(d，20-C)，25.8(q，29-C)，25.7(t，7-C)，22.1(q，21-C)，20.4(t，6-C)，19.6(s，19-C)，19.6(s，28-C)，15.4(q，30-C)，13.3(q，18-C)。COCH3部分170.9(s，CO)，21.5(q，COCH3)。木糖部分107.6(s，1』-C)，78.7(d，3』-C)，75.7(d，2』-C)，71.3(d，4』-C)，67.2(t，5』-C)。
紅外光譜數據IR(KBr)νmax3650-3200，1740，1720，1290，1255，1090，1045cm-1。
3、化合物K-13的化學結構 化合物K-13，為從升麻乾燥地上部分用80％乙醇提取物中分離得到的升麻內酯A(Cimilactone A)。
4、化合物K-13的抗補體生物活性作用化合物K-13的抗補體生物活性實驗將含有80μl補體血漿的正常人血漿稀溶液，和加了樣品和沒有加樣品的80μl明膠GVB2+緩衝液混合。每個樣品溶於DMSO，並將其作為陰性對照。混合液在加進40μl被激活的血紅細胞(羊血紅細胞)之後，將混合物在37℃下預培養30分鐘。在相同的實驗條件下培養之後，混合物在4℃下1500rpm離心，取100μl上清液用在450nm下測定光密度(Yamada et al.，1985)用Yamata H.，Ohtani K.，Kiyohara H.，Cyong J.C.，Otsuka Y.，Ueno Y.，Omura S.，1985.Purification and chemical properties of anti-complementarypolysaccharide from the leaves of Artemisia princes.Planta Medica 51121-125.的方法做；然後採用三次測定方法計算抗補體活性，IC50值由對照的補體依賴溶血作用計算給出(Oh et al.，1996)。按Oh S.R.，Jung K.Y.，Lee H.K.，1996.Invitro anti-complementary activity of phenylpropanoids from Agastache rugosa.Korean Journal of Pharmacognosy 2720-25.報導的方法做。
表1 K-13化合物抗補體活性實驗數據陽性對照Tiliroside Conc.79μM IC50＝78.58μM

從化合物K-13的抗補體IC50值為28.62μM與陽性對照Tiliroside的IC50＝78.58μM比較，抗補體活性強2.7倍，可以推斷化合物K-13具有較強的抗補體生物活性。
實施例2按實施例1製得K-13，按K-13與賦形劑重量比1∶5的比例加入賦形劑，制粒壓片。
實施例3按實施例1製得K-13，按K-13與賦形劑重量比1∶6的比例加入賦形劑，制粒壓片。
實施例4片劑K-13 20mg澱粉 100mg玉米漿 適量硬脂酸鎂 適量實施例5按實施例1製得K-13，按常規膠囊製劑方法製成膠囊。
實施例6膠囊劑K-1320mg澱粉100mg葡萄糖 200mg硬脂酸鎂適量製備方法將K-13與助劑研勻混合，過篩，在合適的容器中均勻混合，把得到的混合物裝入硬明膠膠囊。
實施例7散劑K-13 20mg澱粉 100mg蔗糖 200mg製備方法將K-13、澱粉、蔗糖研細，混合均勻，過篩，分包即得。
權利要求
1.一種補體抑制劑，其中含有有效量的化合物升麻內酯A和藥學上可接受的載體。
2.權利要求1補體抑制劑的製備方法，其特徵在於取升麻Cimicifugafoetida L.的根莖，粉碎後用甲醇提取三次，每次3-4小時，甲醇提取液過濾除去藥渣後，減壓濃縮至蒸不出甲醇，再加一定量的水稀釋，用石油醚萃取2-3次，回收石油醚後，濃縮得到石油醚提取部位，然後水層再用乙酸乙酯萃取2-3次，回收乙酸乙酯，濃縮得到乙酸乙酯提取部位，用矽膠柱層析分離2-5次，洗脫液用氯仿∶甲醇(或氯仿/丙酮)梯度洗脫，洗脫得到化合物升麻內酯A，然後加入藥學上可接受的載體，得補體抑制劑。
3.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於取升麻Cimicifuga foetidaL.的乾燥根莖，粉碎後用甲醇提取三次，每次4小時，甲醇提取液過濾除去藥渣後，減壓濃縮至蒸不出甲醇，再加一定量的水稀釋之後，用石油醚萃取三次，回收石油醚後，濃縮得到石油醚提取部位，然後水層再用乙酸乙酯萃取三次，回收乙酸乙酯，濃縮得到乙酸乙酯提取部位，乙酸乙酯提取部位用1000g矽膠柱層析分離，洗脫液用氯仿∶甲醇從100∶0；100∶1；50∶1；20∶1到1∶1梯度洗脫，由氯仿/甲醇20∶1洗脫液洗脫得到的部位Fr.4，該分離部位Fr.4用1000g矽膠柱層析再次分離，繼續用洗脫液用氯仿∶甲醇從40∶1；30∶1；20∶1梯度洗脫，由氯仿∶甲醇40∶1洗脫液洗脫得到的部分，濃縮後得到分離部位Fr.4.1，該分離部位Fr.4.1用450g矽膠柱層析再次分離，繼續用洗脫液用氯仿∶甲醇從50∶1；40∶1梯度洗脫，依次得到兩個化合物及分離部位Fr.4.1.1和分離部位Fr.4.1.2，分離部位Fr.4.1.2用150g矽膠柱層析再次分離，用氯仿∶甲醇40∶1洗脫得到化合物升麻內酯A，然後加入藥學上可接受的載體，得補體抑制製劑。
全文摘要
提供一種以有效量的化合物升麻內酯A化合物為活性成分並配於藥學上可接受的載體組成的補體抑制製劑，以及該補體抑制劑的製備方法。
文檔編號A61P43/00GK1618432SQ200410040179
公開日2005年5月25日 申請日期2004年7月9日 優先權日2004年7月9日
發明者邱明華, 孫麗榮, 閔炳善, 李烔奎, 李忠榮, 裴盛基 申請人:中國科學院昆明植物研究所