滇池金線䰾精子超低溫冷凍保存及復甦方法
2023-06-26 19:57:06
專利名稱：滇池金線䰾精子超低溫冷凍保存及復甦方法
技術領域：
本發明涉及一種滇池金線鈀精子超低溫冷凍保存及復甦方法，屬於低溫生物學技術領域。
背景技術：
Sinocyclocheilus grahami (Regan, 1904)又名漠池金線魚、波蘿魚、小洞魚，隸屬於鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)金線把屬(SinocyclocheiIus)。滇池金線魚巴 是滇池流域的特有種，分布於滇池及其流域所在河流、溶洞、暗河之中。滇池金線鈀肉質鮮美，系雲南「四大名魚」之首，1989年，被列為國家II級保護動物，在《中國瀕危動物紅皮書(魚類)》中被列為瀕危等級，在中國物種紅色名錄中被列為VU等級。自上世紀50年代後期以來，由於外來種入侵、水體汙染、生境喪失、過度捕撈等原因，滇池金線鈀在滇池湖體已經消失，現僅存於入湖溪流及龍潭中。若不及時採取有效拯救措施，以後將在自然界中將很難找到滇池金線鈀這一物種；儘管滇池金線鈀人工繁殖已成功，但由於養殖魚類本身的局限性，在人工繁殖中，容易造成雌雄性腺發育不同步；並且在長期的塘養環境下，容易造成種質退化，遺傳多樣性減少、生長速度緩慢、品質下降、對病害和環境脅迫的防禦能力降低，病害發生日趨嚴重，因此對其進行精子冷凍保存技術的研究對於滇池金線鈀優良品種的種質保存及遺傳多樣性保護具有重要意義。經文獻檢索，未見與本發明的相同報導。
發明內容
本發明的目的在於針對現有技術的不足，提供一種能夠簡便、高效、長期保存滇池金線鈀精子的超低溫冷凍及復甦方法。本發明的滇池金線鈀精子的超低溫冷凍及復甦方法，其具體步驟如下a.配子的採集採精方法為輕壓腹部法，選擇形態正常、生長良好、無疾病、達到性成熟的親魚原種或良種，用100 ppm的MS-222麻醉5 min，魚類腹部用毛巾擦乾，然後輕輕擠壓腹部，成熟的精液自然流出到1.5 mL離心管中；b.鮮精活力檢測先用移液器滴一滴水於載玻片上，對準視野，然後用針尖挑取上述精液立即於顯微鏡下攪拌，觀察其活力，鮮精活力在85%以上的精液樣品用於精子冷凍；c.冷凍方法將精液與抗凍液按1:2的體積比稀釋後分裝，經4°C平衡60 min,然後在液氮面上方6 cm處平衡2 min，液氮面上平衡2 min後投入液氮中保存；其中抗凍液為稀釋液D-15+7. 5%乙二醇；d.復甦方法是將凍存管從液氮中取出後置於37°C水浴鍋中快速晃動20 S。使用時，將滇池金線鈀魚卵擠入容器中，按IO5:1的精卵數量比加入解凍後的精液，拌勻，再滴加0. 2 ml激活液，攪拌，使卵受精。本發明的各步驟中所用的百分比為體積百分比。
本發明具有成本低，操作簡便，保存時間長，復甦後精子的活力較高，人工繁殖的滇池金線鈀魚的受精率和孵化率較高，能投入規模生產的優點；對於開展魚類資源恢復與重建也具有重要意義。
具體實施例方式發明人分別於2011年I月I月和2012年I月I月在中國科學院昆明動物研究所珍稀土著魚類保育研究基地，採用本發明方法超低溫冷凍了 80尾滇池金線鈀精液，經檢測，解凍後精子活力平均為59. 3%。滇池金線鈀精子超低溫冷凍保存方法的如下親魚的選擇形態正常、生長良好、無疾病、達到性成熟的原種或良種。配子的採集100ppm 的 MS-222 (Tricaine, CltlH15NO3S)麻醉 5 min,魚類腹部用毛巾擦乾，然後輕輕擠壓腹部，成熟的精液自然流出到1.5 mL離心管中。 鮮精活力檢測先用移液器滴一滴水於載玻片上，對準視野，然後用針尖挑取上述精液立即於顯微鏡下攪拌，觀察其活力，鮮精活力在85%以上的精液樣品用於精子冷凍。冷凍方法將精液與抗凍液(D-15+7. 5%乙二醇)按1:2的體積比稀釋後分裝，經4°C平衡60min，然後在液氮面上方6cm處平衡2min，液氮面上平衡2min後投入液氮中保存。復甦方法將凍存管從液氮中取出後置於37°C水浴鍋中快速晃動20 S。凍精活力檢測先用移液器滴一滴水於載玻片上，對準視野，然後用針尖挑取上述精液立即於顯微鏡下攪拌，觀察其活力。2012年3月12日復甦2011年2月21日超低溫冷凍保存的10尾滇池金線鈀精液，採用人工授精的方法，按IO5 1的精卵數量比例進行人工授精，獲得受精卵48715粒，受精率平均為52. 9%，多細胞期、神經胚期和體節期的胚胎存活率分別為90. 8%,66. 0%和46. 8%，孵化率為35. 3% ；2012年3月19日完成魚苗孵化，孵出魚苗9097尾。
權利要求
1.、一種滇池金線鈀精子超低溫冷凍保存及復甦方法，其特徵在於該保存及復甦方法的具體步驟如下 a.配子的採集採精方法為輕壓腹部法，選擇形態正常、生長良好、無疾病、達到性成熟的親魚原種或良種，用100 ppm的MS-222麻醉5 min，魚類腹部用毛巾擦乾，然後輕輕擠壓腹部，成熟的精液自然流出到1.5 mL離心管中； b.鮮精活力檢測先用移液器滴一滴水於載玻片上，對準視野，然後用針尖挑取上述精液立即於顯微鏡下攪拌，觀察其活力，鮮精活力在85%以上的精液樣品用於精子冷凍； c.冷凍方法將精液與抗凍液按1:2的體積比稀釋後分裝，經4°C平衡60min，然後在液氮面上方6 cm處平衡2 min，液氮面上平衡2 min後投入液氮中保存；其中抗凍液為稀釋液D-15+7. 5%こニ醇； d.復甦方法是將凍存管從液氮中取出後置於37°C水浴鍋中快速晃動20S。
全文摘要
滇池金線䰾精子超低溫冷凍保存及復甦方法，屬於低溫生物學技術領域。方法為選擇性成熟的優質原種或良種，用100 ppm的MS-222麻醉5 min，擠壓擦乾的腹部，成熟精液流入1.5 mL離心管，檢測鮮精活力，活力在85%以上的精液用於冷凍。將精液與抗凍液(D-15+7.5%乙二醇)按體積比12的比例稀釋，分裝，4℃平衡60 min，在液氮面上方6 cm處平衡2 min，液氮面上平衡2 min後投入液氮中保存。精子復甦方法是在37℃水浴快速晃動20 s解凍，將擠出的滇池金線䰾魚卵與解凍後的精液按1105的數量比混合使卵受精。本發明具有成本低，操作簡便，保存時間長，復甦後精子的活力較高，人工繁殖的滇池金線䰾魚的受精率和孵化率較高，能投入規模生產的優點；對於開展魚類資源恢復與重建也具有重要意義。
文檔編號C12N5/076GK102763641SQ201210277918
公開日2012年11月7日 申請日期2012年8月7日 優先權日2012年8月7日
發明者楊君興, 潘曉賦, 王曉愛, 陳小勇 申請人:中國科學院昆明動物研究所