用胎兒和成年分化細胞重組非人類哺乳動物胚胎的方法
2023-06-08 14:24:31 1
專利名稱：用胎兒和成年分化細胞重組非人類哺乳動物胚胎的方法
技術領域：
本發明涉及利用核移植重組哺乳動物胚胎。
由胚胎通過將體細胞的供體胞核移植到預先摘除胞核的受體細胞胞質(通常是卵母細胞)中生產動物特別是哺乳動物的技術，由於其潛在的應用當前被廣泛關注。在後面的情況中，應特別提到—動物基因轉移在培養液中將感興趣的基因整合到細胞中，然後將其胞核移植到受體卵母細胞中，這樣能夠提高基因轉移的效率；—繁殖具有特定遺傳特性的動物的可能性，不論這些特性是天然的或是由基因轉移所產生的；—遺傳評估幾個動物具有同樣的遺傳性的事實能夠評估遺傳和環境因素對各動物特性的影響。
—獲得胚胎細胞系、然後在體外被鑑別的可能性。
在利用核移植進行重組胚胎的技術發展中遇到的主要障礙來自於供體胞核/受體胞質相互影響的配合，這是未來胚胎的發展所依賴的。
因此常規的胞核移植的方法包括，在胞核移植之前，準備供體細胞和/或受體細胞。
在體外成熟之後，使用的受體細胞通常在中期II階段由卵母細胞去核產生。在細胞周期這一階段，胞質具有相當大的MPF(成熟促進因素)活性，從胞質被活化的時間開始上述活性逐漸減小。在自然授精的情況下由於精子的進入而產生的該活化可以在胞核移植的情況下被人工引發。
當胞核的移植和受體胞質的活化同時發生時(當胞核和胞質的融合通過足以能夠刺激後者的電脈衝實現時)，高MPF活性引發核膜的降解、染色質的凝聚，在融合之後使胞核物質立即暴露於中期胞質環境。據報導，〔CAMPBELL等，Biol.Reprod.，49，933-4942，(1993)〕，這些現象冒著引起染色體異常的風險，特別是當供體胞核處於細胞周期的G2或S期中。
為了避免染色質的過早凝集且為了保持核膜完整，已經提出[BARNES等，Mol.Reprod.Dev.，36，33-41，(1993)；STICE等，Mol.Reprod.Dev.，38，61-68，(1994)]預先活化受體胞質，僅當獲得分裂間期型的胞質環境時才進行胞核的移植，其特別導致低水平的MPF活性，或者是使用由成熟(old)卵母細胞源發的受體胞質[CHESNE等，CRAS，316，487-492，(1993)]，其對於活化更加敏感，並且其中向著細胞間期的過渡更加迅速。
該方法能夠提高當胚胎細胞(裂球(blastmer))被用作供體細胞時的成功率。另一方面，特別是在牛類中，在從分化的體細胞的胞核源發的胞核的情況下，效率更低，其中胚胎發育的比率保持非常低[VIGNON等，C.R.Acad.Sci.Paris，321，734-745，(1998)；RENARD等The Lancet，353，1489-1491，(1999)]。
根據另一種方法，來自分化細胞的供體胞核與處於中期中的受體胞質的因子的接觸具有這樣的結果，即容許胞核的重新編程，並恢復其全能性。命名為ROSLININSTITUTE的PCT國際申請WO97/07668(發明人WILMUT等)提出為了延長源自供體胞核物質和受體胞質之間的接觸，在融合之後僅活化卵母細胞幾個小時。為了在這些條件下保持正確的倍性，需要在G0和G1期中使用供體細胞，並穩定或抑制在活化是微管的形成。
命名為ROSLIN INSTITU的PCT國際申請WO 97/07669(發明人WILMUT等)推薦使用在沒有血清的情況下預先進行培養一段時間、從處於靜止期(細胞周期的G0期)的細胞獲得的胞核；通過使其更易於從受體細胞接受胞質因子，這種處理也被認為是便於供體胞核的重新編程。這種方法特別能夠改善從分化細胞的胞核獲得的胚胎的發育率，特別是在綿羊種中。WAKAMAYA等(Nature，394，369-374，1998)報告了在小鼠中由胞核獲得的胚胎在G0或G1期的發育，以及被注入到卵母細胞的胞質中的分化的卵丘細胞在注射之後活化1至3小時的中期II的發育。
本發明開發了一種在體外重組哺乳動物胚胎的新方法，其能夠改善來自多種胎兒或成年組織的體細胞的胞核的存活胚胎的產出率和發育率。
該方法包括，在體細胞的二倍體胞核移植進入受體胞質中之前，對該體細胞的二倍體胞核進行處理，所述處理包括a)受控的非組蛋白蛋白水解，b)所述胞核的同形膨脹的誘導。
該處理的效果是使得胞核DNA更加容易取得，且對於胞質環境的活性更強，其中即使在核膜沒有破裂時也有能夠與胞核結構相互作用的因子[ADENOT等，Development，124，4615-4625，(1997)；THOMPSON等，Dev.Genetics，42，22-31，(1998)]。在第一次胚胎分裂之前，胞核膜的保存能夠使正確的倍性被保持。
特別地，二倍體核可以由源自各種組織(例如，乳腺或皮膚上皮細胞、肌細胞、肝細胞等)的胎兒細胞或成年細胞的原始培養獲得。這些細胞可以未分化地來源於新鮮原始培養物或經過數代建立的培養物或通過冷凍保存的細胞恢復的細胞。上述細胞不論其在細胞周期的哪個時期都可以被應用。
按照本發明的方法從這些供體細胞中摘除胞核並進行處理，然後通過顯微注射移植到受體胞質中；然而，在實踐中更便利的是處理包含在供體細胞中的胞核，然後通過受體胞質和供體細胞的融合進行胞核移植。
在後一種情況下，本發明的方法的實施需要一個預先的步驟，即為了使胞核更容易進行處理操作，對供體細胞的胞質膜進行滲透。
例如，原生質膜的滲透可以通過用一種或多種溫和的滲透劑溫育細胞而獲得，例如，溶血卵磷脂、鏈球菌溶血素、皂苷或毛地黃皂苷，假設使用的條件不會引起細胞溶解，並且使原生質膜保持在一種與受體卵母細胞融合的後續操作相適合的狀態下。可以使用的劑量和培養條件根據細胞源變化。適宜的條件通過預先使用錐蟲藍的滲透測試來確定；在顯微鏡下能夠容易地觀察到被滲透的細胞變為藍色。適宜的條件符合給出50％-100％的可滲透細胞。滲透處理與蛋白質水解同時進行並且應在胞核的誘導膨脹之前，其需要較長的溫育時間。
對於受控的蛋白水解，可以使用絲氨酸蛋白酶，例如胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶；蛋白酶的作用必須限制於胞核非組蛋白蛋白以及環繞胞核的細胞骨架的蛋白質的降解，並且必須不導致胞核的溶解。通常，使用非常低的蛋白酶濃度。例如，在整個細胞進行蛋白質水解的情況下(與滲透或其連續地同時)，級別為1至10U/ml的胰蛋白酶濃度可以被用於細胞培養混合物中，培養在37℃下持續1至10min。在處理分離的胞核的情況下，蛋白酶劑量和培養時間必須進一步減小。
另外，在處理過程[BROWN等，Exp.Cell Res.，104，207-213，(1977)]中，胰蛋白酶對於處於G1或G0時期的細胞中的DNA聚合酶具有直接的激活效果。這將能夠使得當它們被混入處於細胞中的受體胞質中時，更容易重新開始處於G0/G1時期的胞核的細胞周期。
如在KAREMER和COFFEY[Biochim.Biophys.Acta，224，568-578，(1970)]中所描述的，胞核的膨脹可以使用至少一種聚陰離子化合物通過處理而誘發，例如肝素、葡聚糖硫酸酯或高分子量(＞20000)的聚天冬氨酸。
在蛋白質水解之後或與其同時，在有聚陰離子的情況下，通過培養胞核或包含胞核的細胞來實施處理，直到觀察到胞核膨脹為止。例如，在滲透整個細胞的情況下，可以使用50到200μg/ml培養基的聚陰離子，在室溫(15℃到25℃)下培養30至60分鐘。
在該處理結束時，胞核被移植到受體胞質中。
根據本發明處理的胞核的移植不論在供體細胞的細胞周期的哪個時期或受體胞質的哪個時期都可以進行。在胞核和受體卵母細胞在中期II(在成熟開始後20到25h)融合的情況下，需要活化重組胚胎，例如通過使用如LIU等描述的化學激活方法[Mol.Reprod.Dev.，49，298-307，(1998)]，或通過其它方法。
然而，特別有利的是使用預先準備從而使其處於細胞間期的受體胞質。
「細胞間期中的受體胞質」被定義為這樣一種胞質，其中MPF的水平小於其誘發核膜降解和染色質凝集時的水平。
特別地，該胞質可以由在體內或在體外成熟的卵母細胞獲得。染色體物質通過顯微操縱被提取，而卵母細胞被阻斷在中期II階段。然後處理獲得的胞質，以便減小MPF活性。例如，它可以通過融合之前的體外老化和冷卻方法[CHESNE等，C.R.Acad.Sci.，316，487-491，(1993)]來製備。使用抑制蛋白質合成(環己醯亞胺)或者是抑制磷酸化作用(6-DMAP)的藥物或這兩種藥物的混合物也能夠獲得相同的結果。在這種情況下，細胞間期狀態通常通過培養1至4小時獲得。
在分離的胞核的情況下，通過顯微注射可以重組胚胎。然而，特別有利的是直接使用被處理的細胞，以便將它們與受體胞質融合。在這種情況下，融合最好通過電擊或其它方法進行。不需要在為了誘發受體胞質的活化的條件下進行操作。
將重組的胚胎直接在體外培養，而不需要在融合之後進行任何其它活化；直到它們生長到胚泡階段。
供體胞核不經歷其核膜的任何破壞，在發生於融合之後的第一次分裂之前不發生任何染色質凝集(PCC)。
根據常規公知技術，當胚胎達到了胚泡階段時，它們被移植到受體雌性體內。
根據本發明的方法，其首先能夠依靠融合之前的溫和的酶促作用容許胞質的因子接近染色質，以提高移植的胞核的重組，其次，通過使染色質凝集最小化及防止在被引入受體胞質中的胞核的重新模造(remodeling)期間它的分散來促進胚胎細胞的正確倍性的維持。這種胞核和胞質之間關係的最初步驟中的修飾能夠促進由分化的體細胞的胞核重組的胚胎的最終發育，不論是在這些細胞的細胞周期中的哪個階段。
該方法適用於多種哺乳動物物種；然而，更特別適合於重組有蹄哺乳動物，特別是反芻動物，以及特別適膈於綿羊種、牛、和山羊家族的成員或豬。
通過下文的進一步描述，將更加易於理解本發明，下文的描述涉及實施用於重組牛類胚胎的本發明方法的非限定性實例。
實施例1細胞的製備和胚胎的重組由胎兒皮膚或肌肉細胞培養物獲得供體細胞，或由成年動物的耳活組織(皮膚細胞)培養物獲得供體細胞，按照VIVNON等描述的方法製備(C.R.Acad.Sci.Paris，321，735-745，1998)。在這些條件下，可獲得成纖維細胞型的分化細胞。
從細胞培養皿中去除培養基，用PBS緩衝劑衝洗，並填充「滲透」介質，其組成為不含鈣和鎂的HANKS平衡鹽水，在胎兒皮膚細胞的情況下包含0.5μg/ml胰蛋白酶和20至30μg/ml的溶血卵磷脂，在成年動物皮膚細胞的情況下，含有15至20μg/ml溶血卵磷脂。在37℃下培養5分鐘之後，從培養皿中去除培養基，為了停止滲透和蛋白水解，立即使用緩衝劑溶液(不含鈣和鎂的HANKS平衡鹽水)衝洗培養皿，該緩衝劑包含0.5％的胎牛血清或牛血清白蛋白。
然後將培養皿填充「聚陰離子」介質，該介質的組成為不含鈣和鎂的HANKS溶液，包含10U/ml的肝素。培養在室溫下進行30到60分鐘。然後通過刮培養支持物收集細胞，以1200g離心5分鐘，在受體卵母細胞融合之前，重新留存在無血清培養基中。
摘除受體卵母細胞胞核，並按照VIGNON等(C.R.Acad.Sci.Paris，321，735-745(1998))所描述的方案使之進入細胞間期。
在受體胞質的透明帶下，通過引入分離的供體細胞進行胞核移植，並在以下條件下進行融合2個2.2kv/cm電脈衝，持續20μs，在補充5μg/ml的細胞鬆弛素B的TCM199培養基(LIFE TECHNOLOGIES，CergyPontoise，France)中。
利用雙目顯微鏡下觀察證實融合，重組的胚胎在體外培養，並被植入體內，如VIGNON等(C.R.Acad.Sci.Paris，321，735-745，(1998))所述。
對照通過上述方案得到對照，但是對供體細胞既不進行滲透也不進行胰蛋白酶和肝素處理。
結果在來自胎兒皮膚或肌肉細胞的情況下，在用經曆本發明處理的供體細胞重組633個胚胎(7.1％)之後，獲得47個胚泡。通過與對照細胞比較，從386個重組胚胎獲得13個胚泡(3.37％)。
在從經曆本發明處理的供體細胞獲得的胚胎移植之後，27頭受體母牛有5頭懷孕超過90天，並生出4隻存活的動物。對於對照細胞，6頭受體母牛接受移植，僅有一個懷孕超過90天，但沒有達到整個期限(懷孕8個月晚期流產)。
在由成年動物耳活組織得到的細胞的情況下，在用經曆本發明處理的供體細胞進行580個胚胎重組之後，產生23個胚泡(4％)，而從採用對照細胞的250個重組胚胎中獲得6個胚泡(2.4％)。移植所有的胚胎，由處理的細胞產生的一系列胚胎中，有一個出生。
實施例2在另一系列試驗中，根據在上述實施例1中描述的方案，由增殖培養物或由置於靜止狀態的培養物(在它們使用之前，將它們保持在無血清介質中36到48小時)衍生的胎兒或成年牛體細胞重組胚胎。如上述實施例1所描述，同樣重組對照胚胎。
結果通過表I和II顯示。表I表示由增殖培養物獲得的供體細胞所得到的結果。
表I
表II表示由靜止的供體細胞獲得的結果表II
這些結果顯示出，關於使用細胞間期的受體胞質，供體細胞(靜止或增殖)的初態對於胚胎發育率沒有顯著影響；另一方面，根據本發明對供體細胞的處理顯著增加了其發育率。
將在上述2個試驗結束時獲得的胚泡移植到受體母牛體內。結果在下文的表III中顯示。
表III
這些結果證實根據本發明對供體細胞的處理顯著增加了可以產生存活動物的胚胎的出生率。
實施例3供體細胞為來源於培養的胎兒或成年牛皮膚細胞的增殖成纖維細胞。它們按照實施例1製備。在15-20μg/ml的溶血卵磷脂的存在下，通過溫育完成滲透。
在體外成熟22至24小時之後，受體卵母細胞被摘除胞核，並在於實施例1相同的條件下與供體細胞融合24-25小時。融合之後，根據如LIU等[Mol.Reprod.Dev.，49，298-307，(1998)]所述方法的進行化學活化在融合之後立即將重組的胚胎在含有10μg/ml的放線(菌)酮和5μg/ml細胞鬆弛素B的TCM199培養基中(LIFE TECHNOLOGIES，CergyPontoise，France)溫育5小時。然後在體外培養胚胎。以相同方式重組對照胚胎，但在融合之前不進行供體細胞的處理。
結果在下文的表IV和V中給出表IV
表V
+這兩隻動物在出生幾個小時之後死亡。
權利要求
1.在體外重組非人類哺乳動物的方法，其特徵在於，其包括在體細胞的供體細胞的二倍體核被移植到受體胞質中之前，對其進行處理，所述處理包括a)受控的非組蛋白質的蛋白水解，和b)誘導所述胞核的同形態膨脹。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於受控蛋白水解在絲氨酸蛋白酶的作用下產生。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於所述蛋白酶為胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶。
4.根據權利要求1至3中任何一個所述的方法，其特徵在於通過使用聚陰離子進行處理誘導胞核的膨脹，所述聚陰離子選自肝素、葡聚糖硫酸酯和分子量大於20000的聚天冬氨酸。
5.根據權利要求1至4中任何一個所述的方法，其特徵在於經處理的胞核被包含在供體細胞中，所述處理包括所述細胞的胞質膜的滲透。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述胞質膜的滲透利用至少一種滲透劑進行，所述滲透劑選自溶血卵磷脂、鏈球菌溶血素、皂苷和毛地黃皂苷。
7.根據權利要求1至4中任何一個所述的方法，其特徵在於通過顯微注射將胞核移植到受體胞質中。
8.根據權利要求5和6中任何一個所述的方法，其特徵在於通過供體細胞和受體胞質的融合將胞核移植到受體胞質中。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於所述融合通過電擊進行。
10.根據權利要求1至9中任何一個所述的方法，其特徵在於受體胞質處於細胞間期狀態。
11.根據權利要求1至10中任何一個所述的方法，其特徵在於所述哺乳動物是有蹄類動物。
12.根據權利要求11所述的方法，其特徵在於所述有蹄類動物選自牛、綿羊種，山羊家族成員和豬。
全文摘要
本發明涉及利用一種方法在體外重組非人類哺乳動物胚胎,該方法包括在供體體細胞的胞核被移植到受體胞質中之前對其進行處理,所述處理包括受控的非組蛋白水解和誘導所述胞核的同形態膨脹。
文檔編號C12N15/873GK1377226SQ0081369
公開日2002年10月30日 申請日期2000年9月29日 優先權日1999年10月1日
發明者J－P·萊納德, X·維格農 申請人:國家農藝研究院