自動化血凝抑制實驗工作站的總體設計方案及其用途的製作方法
2023-06-01 13:55:06 1
本發明屬於醫學生物學實驗技術領域,涉及一種用於大批量血凝抑制(hi)實驗的工作站總體設計方案。該工作站是針對hi實驗的特定步驟設計的,由反應液分配、樣品倍比稀釋、抗原分配、紅細胞分配、結果記錄等五個工作模塊,以及帶有微量血凝板輸送功能的底座組成。該工作站可批量化地檢測人與動物禽流感、新城疫、腺病毒等的hi抗體效價,也可用於檢測口蹄疫、豬瘟等的間接血凝(iha)抗體效價。
背景技術:
血凝(ha)和血凝抑制(hi)實驗是一種常用的免疫學測定技術,用於檢測具有紅細胞凝集活性的病毒的抗體效價。在醫學和學實驗室中,是檢測禽流感病毒、新城疫病毒、腺病等抗體效價的常用經典方法,可以用於診斷疾病、評價疫苗免疫效果、監測血清抗體水平。該實驗方法在我國各級衛生及動物防疫部門、診療機構和養殖企業大量應用,每年的抗體監測數量達到數百萬份。例如僅2013年4-6月,農業部家禽h7n9就監測了163.02萬份(人民網2014年01月27日)。
當前實驗室中開展hi實驗,主要依靠人工操作,使用的器械主要是手持式的微量加樣器,由於檢測樣本量多,所以人工成本高、工作強度大、費時費力。雖然少數實驗室在hi檢測過程中採用了8通道電動分液機來輔助加液(例如thermoscientific微孔板自動分液器),但是整個檢測過程仍然主要依賴人工操作。實驗室已有針對pcr、elisa實驗的自動移液工作站(例如biomek®nxp工作站、t-easy工作站),但是其結構及功能不適應於hi的實驗過程,因此未能在實驗室中實際用於大批量樣本的hi檢測。目前,尚未見到專門針對hi主要實驗步驟而設計開發的自動化檢測工作站。
目前,醫學與生物學領域的自動化儀器設備很多,特別是針對pcr、elisa等實驗,市場上已有各種自動化的液體連續分配器、多通道的微量移液器、96或384孔反應板移動機械臂、圖像拍攝與處理系統等。這些常見技術和設備,為本發明的實現提供了良好基礎條件。
本發明通過分析hi實驗的具體過程,針對hi實驗各個步驟的功能需求,選擇合適的工作模塊參數,並統籌考慮模塊之間的配合效率;同時,還創造性地採用具有微量血凝板移動功能的儀器底座,從而實現不間斷地實驗檢測,最終形成一種大批量hi檢測工作站的總體設計方案。據此開發和製造相應的儀器裝置,能夠自動化進行大批量hi檢測實驗,預期可以在我國各級醫學與動物防疫實驗室廣泛應用。
技術實現要素:
本發明所要解決的技術問題是:針對hi實驗,提出自動化hi檢測工作站總體設計方案,用於大批量樣本檢測,減少人工操作,降低勞動強度。
本發明從分析hi實驗的基本操作過程入手,將其按先後順序劃分成五個基本步驟。針對hi實驗各個步驟的功能需求,分別設置反應液分配、樣品倍比稀釋、抗原分配、紅細胞分配、結果記錄等五個工作模塊。通過分析各工作模塊的功能要求,同時兼顧工作模塊之間的配合效率,確定了各工作模塊的關鍵參數和配置要求。最後,按實驗操作的順序,將這些工作模塊組裝在帶有微量血凝板輸送功能的底座上(同時,也可以輔助採用機械臂抓取和移動微量血凝板),構成一套完整的自動化hi實驗工作站,能夠按流水線的工作方式,不間斷地進行大批量hi檢測實驗。
一、hi實驗的工作模塊設置
為了解決以上技術問題,首先根據人工操作微量hi實驗的基本過程,將其劃分為五個操作步驟:
步驟一反應液分配:在96孔微量血凝板上,每孔加入1個反應體積(20~100μl,常用25μl,下同)反應液。
步驟二樣品倍比稀釋:在第1列的8個孔,每孔加入1個樣本(1個反應體積)。混合均勻後,吸取1個反應體積,轉移到第2列。依次同樣操作,直至第8列。
步驟三抗原分配:在第1至8列,每孔加入1個反應體積抗原液。
步驟四紅細胞分配:每孔加入1個反應體積1%紅細胞懸液。
步驟五結果記錄:記錄每個板孔中紅細胞的凝集狀況。
在此基礎上,確定各主要操作步驟的功能要求,分別選配工作模塊的參數,見表1。
表1.主要工作模塊配置
表1.主要工作模塊配置(續)
表1備註:1.如果選用384孔微量血凝板,工作模塊的管路可選用12、16或24通道的液體分配系統。2.各個步驟反應溶液的體積可以是20μl至100μl。
二、具有血凝板輸送系統的儀器底座
在檢測系統的底板上設置輸送帶,由計算機控制的步進電機驅動。輸送帶採用有一定柔韌度的橡膠或矽膠材質,其上鏤刻成載板框,用於承載和固定96孔或384孔微量血凝板。實驗過程中,輸送帶將微量血凝板從待檢測區域向檢測區域移動,依次通過反應液分配模塊→樣品倍比稀釋模塊→抗原分配模塊→間隔區→紅細胞分配模塊→沉澱區→結果記錄模塊→回收容器。檢測完畢後微量板在輸送帶的折返處,自動脫落到回收容器中。微量板每次移動一排板孔的距離,各工作模塊進行一次相應的實驗操作。這樣,只要不斷在底座的待檢區域的載板框上放入微量板(微量板第一列板孔中加入25μl或50μl樣品),就可以連續進行大批量檢測。一臺工作站單日檢測量可以達到1440份(3分鐘/板(12份),每天開機工作6小時),大約相當於4至5人的工作量(傳統的人工操作,一天大約可檢測300份)。
補充說明:間隔區:用於等待微量板中的抗原抗體發生充分反應。這部分的底座下方安裝著偏心輪振動臺(類似常用的微量板振蕩器),當載有微量板的輸送帶到達此區域時,被兩側的壓緊轉輪向下壓,貼緊下方的振動臺面,通過旋渦振動方式來加速微量板中的抗原抗體反應。沉澱區:微量板僅是緩慢通過此區域,等待紅細胞發生沉澱,最後到達結果記錄模塊。回收容器:在結果記錄區的輸送帶的末端,下方放置一個託盤,用於盛裝檢測完畢的微量板。當輸送帶到達末端時,在輸送帶折返的過程中,輸送帶呈彎曲狀態,微量血凝板將會自動脫落到回收容器中。
除此之外,如果希望進一步提高自動化程度,還可以採用pcr、elisa工作站常用的智能機械臂等輔助裝置與上述主要工作模塊相互配合,當然,這需要考慮組裝成工作站的性價比。例如:可採用智能機械臂直接抓取微量血凝板,自動裝填到底座的待檢區和間隔區;或者將微量板疊起來放置,用於節約儀器內部空間。
三、血凝抑制實驗工作站的總體組裝
血凝抑制實驗工作站的總體組成見圖1。
儀器的底板為長方形,一側區域用於安裝輸送帶,用於承載96孔或384孔微量血凝板。另一側用於放置試劑容器、一次性吸頭盒。
儀器的背側板為長方形,用於安裝和固定各個工作模塊。從儀器的一端至另一端,依次排列著反應液分配模塊、樣品倍比稀釋模塊、抗原分配模塊、紅細胞分配模塊、結果記錄模塊。每個模塊均通過數據線與計算機控制系統相連。
附圖說明
圖1是血凝抑制實驗工作站總體組裝示意圖
1.反應液分配模塊;2.樣品倍比稀釋模塊;3.抗原分配模塊;4.紅細胞分配模塊;5.結果記錄模塊;6.輸送帶;7.間隔區的振動臺;8.壓緊輪;9.沉澱區;10.蠕動泵;11.計算機接口;12.吸頭盒;13.抗原液容器;14.稀釋液容器;15.紅細胞懸液容器;16.待檢區;17.微量板回收容器。
具體實施方式
下面結合具體實施方式對本發明進行進一步的詳細描述,給出的實施例僅為了闡明本發明,而不是為了限制本發明的範圍。下述實施例中的實驗方法,如無特殊說明,均為常規方法。下述實施例中所用的材料、部件等,如無特殊說明,均可從商業途徑得到。
實施例一用血凝抑制實驗工作站進行禽流感血清抗體水平測定
(以配有12通道液體分配頭的血凝抑制實驗工作站為例)
1實驗材料
1.1hi實驗反應液(稀釋液)、1%雞紅細胞懸液,按常規實驗程序配製。
1.2禽流感血凝素抗原,按說明書溶解,稀釋到濃度為4ha單位備用。
1.396孔微量血凝反應板,底部90°v形。
2設定工作站的工作參數:
2.1反應液分配模塊:體積為每孔25μl。
2.2樣品倍比稀釋模塊:吸吹6次混合,移液體積為每孔25μl。
2.3抗原分配模塊:體積為每孔25μl。振動反應5分鐘。
2.4紅細胞分配模塊:體積為每孔25μl。之後沉澱15分鐘。
2.5結果記錄模塊:自動拍攝狀態,每塊微量板拍攝一幅,記錄時間格式為24小時。
3樣品準備:取96孔微量血凝板,在每塊板正面的最左側,豎向粘貼12份樣品的編號(例如:001至012號)。在第一列的12個孔中,按編號順序分別加入樣品25μl。可根據實驗需要設置標準陰性、陽性樣品作為對照。
4血凝抑制(hi)試驗
4.1啟動工作站,選擇hi實驗模式(共有ha、hi兩個模式,ha模式不需要啟動抗原分配模塊)。
4.2取微量血凝板(第一列的12個孔已經裝有待測樣品25μl),放到待檢區的載板框中。可按樣品編號的順序,連續放置微量血凝板。(這個過程可用人工操作,也可另外使用自動機械臂等設備來完成)
4.3檢測過程
4.3.1微量血凝板固定在輸送帶的載板框上,按計算機指令到達「反應液分配模塊」的位置時,12通道液體分配頭向每列的12個孔,分別加入25μl反應液(每加一次液體,微量板移動一列孔的距離),96孔全都加好。這樣,第一列孔中的12份樣品就被稀釋為1:2。
4.3.2微量血凝板到達「樣品倍比稀釋模塊」的位置時,第一列孔中的樣品首先被吹吸6次混合均勻,又被吸取25μl,轉移到第2列的板孔中(每吸取一次液體,微量板移動一列孔的距離)。如此重複操作,樣品就被連續稀釋。從第1列孔到第8列孔,稀釋度分別是1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256。(禽流感檢測的判界是血清滴度≥1:16為陽性)
4.3.3微量血凝板按計算機指令到達「抗原分配模塊」的位置時,每列12孔都被加入25μl抗原液(每加一次液體,微量板移動一列孔的距離)。
4.3.4微量血凝板按計算機指令到達間隔區,被壓緊輪向下壓到旋渦震蕩平臺,震蕩反應5分鐘。
4.3.5微量血凝板按計算機指令到達「紅細胞分配模塊」的位置時。每列的12孔都被加入25μl紅細胞懸液(每加一次液體,微量板移動一列孔的距離)。
(在以上3.3.1至3.3.5過程中,工作站採用固定位置的液體分配頭,則每加一次液體,微量板移動一列孔的距離;如果液體分配頭是安裝在可移動的機械臂上,則微量板可以在每列孔都加完液體後,再繼續往前移動)。
4.3.6微量血凝板按計算機指令到達沉澱區,每塊板按到達的順序排列在輸送帶上,緩慢向前移動,等待紅細胞沉澱。對沉澱時間達到15分鐘的微量血凝板,到達「結果記錄模塊」的位置,拍攝、存儲紅細胞凝集圖像。
4.3.7微量血凝板到達輸送帶末端,自然脫落到回收容器中。
實施例二用血凝抑制實驗工作站進行禽流感病毒血凝效價測定
(以配有12通道液體分配頭的工作站為例)
1實驗材料:
禽流感血凝素抗原作為待檢測樣品。其他實驗材料,同實施例一。
2設定工作參數
抗原分配模塊,停止使用。其他工作參數,同實施例一。
3樣品準備:
將樣品置於96孔微量血凝板的第一列,方法同實施例一。
4血凝(ha)試驗
與實施例一的血凝抑制試驗過程相似。但是,不需要4.3.3、4.3.4這兩步操作。
實施例三用血凝抑制實驗工作站進行o型口蹄疫抗體間接血凝試驗(iha)
(以配有12通道液體分配頭的工作站為例)
1實驗材料
1.1iha實驗反應液,按實驗操作規程配製。
1.2o型口蹄疫血凝抗原、陽性對照血清、陰性對照血清,購自國家口蹄疫參考實驗室,按說明書使用。
1.3待檢血清每份0.5ml,56℃水浴滅活30分鐘。
1.496孔微量血凝反應板,底部110°的v形。
2設定工作參數:
2.1反應液分配模塊:體積為每孔50μl。
2.2樣品倍比稀釋模塊:吸吹6次,移液體積為每孔50μl。
2.3抗原分配模塊:體積為每孔50μl。
2.4紅細胞分配模塊:停用。
2.5結果記錄模塊:自動拍攝狀態,每塊微量板拍攝一幅,記錄時間格式為24小時。
3樣品準備:取96孔微量血凝板,在每塊板正面的最左側,豎向粘貼12份樣品的編號(例如:001至012號)。在第一列的12個孔中,按編號順序加入樣品50μl。可根據實驗需要設置標準陰性、陽性樣品作為對照。
4間接血凝(iha)試驗
與實施例一的血凝抑制(hi)試驗過程相似。但是,不需要4.3.4、4.3.5這兩步操作。