一種用於FGFR3‑1138G＞A基因多態性檢測的電化學傳感器製備方法與流程

2023-06-02 00:42:58 1

本發明涉及一種在臨床上產前無創診斷FGFR3-1138G＞A基因多態性檢測的電化學傳感器的製備方法及應用，尤其是基於金屬有機框架納米複合材料作為信號探針製備的夾心型生物傳感器，用於檢測FGFR3-1138G＞A基因多態性，屬於電化學檢測領域。

背景技術：
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軟骨發育不全(achondroplasia，ACH)是一種常見的常染色體顯性遺傳病，多由軟骨內骨化缺陷而導致的先天性侏儒病。該病患者雖然智力正常但是在體型外表上有嚴重的缺陷，因此會對患者心理造成嚴重的負擔，所以對於該病的早期產前基因診斷是很有效的預防軟骨發育不全缺陷兒出生的措施。99％的ACH患者是由於FGFR3基因第10外顯子1138位G＞A突變、1138位G＞C突變或1123位G＞T突變，其中95％以1138位G＞A突變。基於此，基因型可以被簡化為通過使用FGFR3-1138G＞A多態性作為軟骨發育不全產前診斷的主要標誌物。

傳統對於FGFR3突變基因的檢測主要依賴於電泳分離、超聲檢測、絨毛活檢術、羊水細胞培養和胚外體腔穿刺術。然而這些方法具有侵入性，對醫生的操作要求高且病人不易接受，因此近些年來基因診斷技術越來越多的應用到產前無創診斷。目前常用的基因診斷主要有PCR-單鏈構象多態性分析、基因測序和基因晶片技術。然而PCR的方法容易受到生物樣品中複雜成分的影響，檢測效率低和易出現假陽性而使其應用受到了限制。而基因測序不僅需要專門的儀器設備，訓練有素的工作人員而且檢測過程繁瑣費時，因此不適用於常規臨床檢測。最為主要的是，患者樣品中突變序列相對於高水平野生型序列顯得寡不敵眾，很難獲得較高的特異性。因此製備靈敏度高，特異性強，無創性的檢測方法對於低豐度突變基因的檢測顯得至關重要。近年來，基於納米材料電化學生物傳感器由於簡便，快速，成本低，靈敏度高等優勢而被廣泛應用於生物樣品的檢測。

在電化學生物分析中，信號放大對於提高DNA傳感器的靈敏度是非常重要。近些年來，利用具有催化性質的材料用於信號的放大愈來受到重視。氯高鐵血紅素(Hemin)由於其模擬過氧化物酶的性質而受到廣泛的關注，但是單獨的Hemin在中性和鹼性環境中不僅分散性差而且催化壽命短，因此需要一個載體來保護Hemin。於是金屬有機框架(MOFs)被用來有效的固定和保護Hemin，既可以促進Hemin的分散又可以延長Hemin的催化壽命。為了能進一步增強催化性能，實現更多的信號放大，具有催化性能的鉑納米顆粒(PtNPs)是很好的選擇，因為PtNPs也具有很強的催化性能。因此將這三者結合形成的複合材料Hemin-MOFs-PtNPs具有三種材料的優點並且催化性能也是最優的，而且因為有PtNPs的存在，也可以與信號探針結合，通過信號探針與目標序列的特異性結合可以用於構建夾層型生物傳感器。

本發明基於Hemin-MOFs-PtNPs納米複合材料構建生物信號探針，建立了一種FGFR3-1138G＞A基因多態性檢測的電化學DNA生物傳感器的製備方法與應用，為產前無創診斷軟骨發育不全提供了新的思路。

技術實現要素：
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本發明的目的是提供一種產前無創診斷軟骨發育不全的FGFR3-1138G＞A基因多態性檢測的電化學DNA生物傳感器的製備方法與應用，其特徵包括以下步驟：

(1)氯高鐵血紅素(Hemin)-金屬有機框架(MOFs)-鉑納米顆粒(PtNPs)-單鏈脫氧核糖核酸(ssDNA)檢測探針的製備；

(2)建立電化學DNA生物傳感器，測定FGFR3-1138G＞A基因，繪製標準曲線。

本發明所述Hemin-MOFs-PtNPs-ssDNA複合物的製備過程具體包括以下步驟，其特徵在於包括以下步驟：

(1)Hemin-MOFs納米複合材料的製備：

0.126g 2-氨基對苯二甲酸，0.187g FeCl3·6H2O和0.226g Hemin溶於15mL DMF中，混勻。將上述溶液油浴加熱4h，在加熱開始後15min時加入200μL的冰醋酸，加熱結束後控制溶液降溫至室溫。所得溶液10000/min離心5分鐘，分別用DMF，無水乙醇，超純水各清洗三次。所得產物真空乾燥24h後重新分散在超純水中形成1mg mL-1體系，備用。

(2)Hemin-MOFs-PtNPs納米複合材料的製備：

1mL H2PtCl6(1％)加入1mL(1mg mL-1)Hemin-MOFs溶液中，劇烈超聲15min。所得溶液置於磁力攪拌器上，在400轉/分鐘的攪拌下，逐滴加入2mL NaBH4(0.1M)至溶液由棕褐色變為黑色，繼續攪拌30min。上述混合溶液10000/min離心5分鐘，用超純水清洗三次。所得產物重新分散在超純水中，4℃備用。

(3)Hemin-MOFs-PtNPs-ssDNA複合物的製備：

用高於100倍的TCEP室溫處理巰基修飾的單鏈DNA，1h。將處理後的檢測探針加入Hemin-MOFs-PtNPs溶液中4℃攪拌過夜後離心，並用PBS(0.1M，pH＝7.4)清洗。將合成的Hemin-MOFs-PtNPs-ssDNA重新分散在1mL雜交液中，4℃保存備用。

本發明中所述的建立電化學DNA生物傳感器，測定FGFR3-1138G＞A基因的DNA片段，繪製標準曲線，其特徵在於包括以下步驟：

(1)分別用0.3和0.05μm的Al2O3粉末將電極拋光成鏡面，然後分別按超純水、無水乙醇、超純水的順序超聲電極各5min，室溫乾燥備用；

(2)將6μL，2mg mL-1rGO-TEPA滴加在電極表面，室溫乾燥；

(3)將乾燥後的電極浸入1％的氯金酸溶液中，恆壓法-0.2V沉積30s。

(4)用超純水將電極衝洗乾淨後滴加10μL，1μg mL-1親和素溶液並置於4℃孵育12h。

(5)用超純水將孵育後的電極衝洗乾淨後滴加10μL，1μM生物素標記的DNA捕獲探針溶液，4℃孵育12h。

(6)用超純水將孵育後的電極衝洗乾淨後滴加6μL，0.25％的BSA溶液室溫孵育30min。

(7)將上述BSA封閉後的電極用清洗緩衝液(10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，37mM NaCl，2.7mM KCl，pH 7.4)衝洗乾淨並在氮氣中乾燥。

(8)將不同濃度的目標DNA滴加在電極上並置於37℃雜交2h。

(9)在乾燥後的電極上滴加10μL檢測探針混合液置於37℃孵育2h。

(10)將孵育後的電極用清洗緩衝液衝洗乾淨後置於氮氣中乾燥。

(11)將電極置於5mL，0.1M PBS(0.1M Na2HPO4，0.1M KH2PO4，0.1M KCl)中進行表徵，每隔100s加入20μL，1.2mM H2O2，測量其計時電流變化電流值。

(12)根據所得電流變化值與FGFR3-1138G＞A基因DNA片段濃度呈線性關係，繪製工作曲線。

與現有技術相比，本發明的一種產前無創診斷的FGFR3-1138G＞A基因多態性檢測的電化學DNA生物傳感器的製備方法與應用，其突出的特點是：

(1)將基於Hemin-MOFs-PtNPs的納米複合材料作為信號探針引入到電化學DNA生物傳感器的製備中，不僅有效的提高了材料的催化性能，而且提高了生物分子的固載量，進而提高了電化學DNA生物傳感器的靈敏度和生物相容性；

(2)通過使用生物素標記的捕獲探針用於識別目標DNA，它不僅確保了捕獲探針在親和素修飾的電極表面固定的良好取向，而且通過增加傳感器表面用於分子識別的捕獲探針密度進而提高了傳感器的靈敏度；

(3)本方法製備的電化學DNA生物傳感器可為產前無創診斷軟骨發育不全提供新方法，進而拓展產前無創基因診斷在常規臨床的應用；

(4)使用完全相同的納米材料和修飾方法，利用捕獲探針，信號探針與目標DNA的特異性識別，只需通過改變探針的核酸序列即可實現多種單基因遺傳疾病產前無創診斷的特異性，高靈敏檢測，另外，此方法簡便，快速，便於實現商品化，從而推進轉化醫學的發展。

附圖說明：

圖1為本發明的電化學DNA生物傳感器的構建示意圖。

圖2為本發明的信號探針不同合成步驟的掃描電鏡圖，EDS圖和XPS圖。

圖3為本發明的電化學DNA生物傳感器在檢測FGFR3-1138G＞A基因多態性時得到的計時電流變化電流與濃度的線性關係，以及傳感器的特異性與穩定性。

具體實施方式：

下面結合具體實施例對本發明進行進一步闡述，應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。

實施例1

步驟1.0.126g 2-氨基對苯二甲酸，0.187g FeCl3·6H2O和0.226g Hemin溶於15mL DMF中，混勻。將上述溶液油浴加熱4h，在加熱開始後15min時加入200μL的冰醋酸，加熱結束後控制溶液降溫至室溫。所得溶液10000/min離心5分鐘，分別用DMF，無水乙醇，超純水各清洗三次。所得產物真空乾燥24h後重新分散在超純水中形成1mg mL-1體系，得到Hemin-MOFs；

步驟2.1mL H2PtCl6(1％)加入1mL(1mg mL-1)Hemin-MOFs溶液中，劇烈超聲15min。所得溶液置於磁力攪拌器上，在400轉/分鐘的攪拌下，逐滴加入2mL NaBH4(0.1M)至溶液由棕褐色變為黑色，繼續攪拌30min。上述混合溶液10000/min離心5分鐘，用超純水清洗三次。所得產物重新分散在超純水中，4℃備用；

步驟3.用高於100倍的TCEP室溫處理巰基修飾的單鏈DNA，1h。將處理後的檢測探針加入Hemin-MOFs-PtNPs溶液中4℃攪拌過夜後離心，並用PBS(0.1M，pH＝7.4)清洗。將合成的Hemin-MOFs-PtNPs-ssDNA重新分散在1mL雜交液中，4℃保存備用；

步驟4.分別用0.3和0.05μm的Al2O3粉末將電極拋光成鏡面，然後分別按超純水、無水乙醇、超純水的順序超聲電極各5min，室溫乾燥備用；

步驟5.將6μL，2mg mL-1rGO-TEPA滴加在電極表面，室溫乾燥；

步驟6.將乾燥後的電極浸入1％的氯金酸溶液中，恆壓法-0.2V沉積30s；

步驟7.用超純水將電極衝洗乾淨後滴加10μL，1μg mL-1親和素溶液並置於4℃孵育12h；

步驟8.用超純水將孵育後的電極衝洗乾淨後滴加10μL，1μM生物素標記的DNA捕獲探針溶液，4℃孵育12h；

步驟9.用超純水將孵育後的電極衝洗乾淨後滴加6μL，0.25％的BSA溶液室溫孵育30min；

步驟10.將上述BSA封閉後的電極用清洗緩衝液(10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，37mM NaCl，2.7mM KCl，pH 7.4)衝洗乾淨並在氮氣中乾燥；

步驟11.將不同濃度的目標DNA滴加在電極上並置於37℃雜交2h；

步驟12.在乾燥後的電極上滴加10μL檢測探針混合液置於37℃孵育2h；

步驟13.將孵育後的電極用清洗緩衝液衝洗乾淨後置於氮氣中乾燥；

步驟14.將電極置於5mL，0.1M PBS(0.1M Na2HPO4，0.1M KH2PO4，0.1M KCl)中進行表徵，每隔100s加入20μL，1.2mM H2O2，測量其計時電流變化電流值；

步驟15.根據所得電流變化值與FGFR3-1138G＞A基因DNA片段濃度呈線性關係，繪製工作曲線；測定結果表明FGFR3-1138G＞A基因片段濃度在0.1fM-1nM範圍內成線性關係，線性相關係數為0.9992，檢測限為0.033fM。

步驟16.將本發明上述傳感器於4℃保存，間斷檢測傳感器電流響應，儲存28天後電流響應仍為初始電流的94.5％，表面傳感器具有良好的穩定性；

步驟17.本發明取同一批次製備的DNA生物傳感器5支，在相同條件下對100pM的FGFR3-1138G＞A基因DNA片段分別進行測定，每一支電極測定3次，結果響應電流的相對標準偏差少於2..76％；同時，取不同批次製備的DNA生物傳感器2支，在相同條件下對100pM的FGFR3-1138G＞A基因DNA片段分別進行測定，每一支電極測定3次，結果響應電流的相對標準偏差少於2.58％，說明傳感器批內及批間差異小，傳感器重現性良好。

步驟18.將本發明上述傳感器用於檢測目標核酸序列，錯配鹼基，結果錯配鹼基電流響應相對於目標核酸序列顯得微不足道，說明傳感器的特異性好，可以很好區分目標序列。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出的是，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提條件下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。