基於切向偏振的超分辨螢光顯微方法及裝置的製作方法

2023-06-03 10:33:51 1

專利名稱：基於切向偏振的超分辨螢光顯微方法及裝置的製作方法
技術領域：
本發明涉及螢光顯微鏡領域，具體涉及超分辨螢光顯微方法及裝置。
背景技術：
自從1873年阿貝第一次發現遠場光學成像具有衍射限制現象以來，物理學界就 公認，遠場光學顯微鏡的解析度受限於光學衍射極限，該極限與光源的波長和數值孔徑有 關。由於光學衍射的限制，理想點物經過光學系統成像不可能得到一個理想的像點，而是成 一個夫琅和費衍射像。一般的光學系統都是圓形的，夫琅和費衍射像就是所謂的艾裡斑。在 像平面每個物點的像都是一個彌散斑，兩個彌散斑靠近就不好區分，這樣限制了系統的分 辨率，彌散斑越大，解析度越低。因此，一個世紀以來，傳統的遠場光學顯微鏡的解析度( 200nm) 一直是無法逾越的障礙。如何突破光學衍射極限進一步提高顯微鏡的解析度，能夠 在光學顯微鏡下觀察更小尺度的物體是一個熱門的話題。潛在的意義是可以在光學顯微鏡 下觀察更小尺度的實時活體生物現象，探索生命奧秘。近年來，隨著4 π共聚焦顯微技術、受激發射損耗顯微技術、光激活定位顯微技 術、飽和結構照明顯微技術等新的理論和技術的出現，遠場光學顯微成像的解析度得到極 大的改進，可以在活細胞上看到納米尺度的蛋白質。這些技術上的進步勢必極大地推動生 命科學的發展。而這些技術之一、由專利號為US5731588的美國專利公開的受激發射損耗 顯微鏡(Stimulated Emission Depletion(STED)microscopy)被譽為最有應用前景的方 法。它是從物理上打破衍射光學極限的遠場螢光顯微技術，對傳統物理學觀點的極大挑戰。 其具體原理為使用一種圓偏振的雷射，僅激發一個點的螢光基團使其發螢光，然後再用一 個麵包圈樣的圓偏振光源抑制那個點周圍的螢光強度，這樣就只有中間一個小於衍射極限 的點發光並被觀察到了。兩束雷射(即激發光與受激發射損耗雷射)經過調製後同時照 射在樣本上相同位置，其中，激發光使螢光物質發光，受激發射損耗雷射(即STED雷射)為 與激發光緊挨著的、環型的、波長較長的一束雷射，使得激發光斑中大部分的螢光物質通過 光學非線性作用強行回到基態，從而抑制螢光發光以減少螢光發射光斑面積。激發光光斑 經STED雷射的調製後，發射螢光分子的光斑大小大大的減少了，並且隨著STED雷射光強的 增加，能發射螢光光斑越小，其半高全寬可以達到衍射極限以下，解析度不再受光的衍射所 限制，從而打破衍射極限。從1994年STED理論的提出，經過多年的實驗後，直到2000年 Hell開發了超高解析度顯微技術，通過三維掃描可以得到IOOnm以下的超高解析度三維圖 像。儘管STED顯微技術得到了一定的發展，然而到目前為止STED原理和方法還沒有 得到廣泛的應用，具體表現在(1)現有的脈衝STED測量系統光路複雜，使用的光學元器件 多，包括昂貴的脈衝雷射器、複雜的電子控制系統等。(2)對系統的穩定性要求非常高，為 了保證解析度，一般工作2 3個小時需要重新校準。(3)為了達到STED效果，STED雷射 的光強密度要比激發光高出1000-10000倍，甚至更高，而如此高的光強對大部分生物樣品 是一個致命的損傷。(4)理論上無限的解析度事實上是有限的，因為在追求高分辨的同時
4也增大了螢光漂白，從而降低成像解析度與成像質量。之後，為了擴大STED系統的焦深， 專利號為US7709809的美國專利提出了組合位相板的方式。為了提高系統穩定性，申請號 201010177761. 6的中國專利提出了一種實時補償漂移的方法。而對於上述的STED工作功 率過高問題，一直沒有得到很好的解決。如何降低STED雷射的工作功率從而降低樣品的漂 白，避免對樣品的損壞，一直是STED顯微技術的一個難題。現有的STED系統中是利用一種 圓偏振光聚集作為激發光，用另外一種波長的圓偏振光(STED光)經過渦旋位相板產生面 包圈去抑制螢光團發射螢光。其特點一是圓偏振激發光難以聚焦到衍射極限以下；二是 利用圓偏振光通過渦旋位相板形成麵包圈去抑制激發光斑周圍的螢光，其抑制效果只有靠 增加STED雷射功率。

發明內容
本發明提供了一種基於切向偏振的超分辨螢光顯微方法，在保證高解析度的條件 下大大降低STED雷射的功率，從而降低樣品的漂白，避免對樣品的損壞。一種基於切向偏振的超分辨螢光顯微方法，包括以下步驟(1)將用於激發螢光樣品產生螢光的激發光轉換為切向偏振激發光；(2)對所述的切向偏振激發光進行0 2 π渦旋位相編碼，得到位相編碼切向偏振 激發光；所述的0 2 π渦旋位相編碼是指對於橫截面中心對稱的圓形入射光束，採用一個 厚度沿角向逐漸增加，增加到一個光的波長量級時所對應的相位為2 π的渦旋分布的0 2 π位相板(Vortex 0 2 π PhasePlate)使該光束產生相對於初始相位的位相延遲，位相 延遲的大小由光束圓形橫截面內過特定點的半徑與+X軸的夾角決定，取值範圍在0 2 π 之間，與該點到圓心的距離無關；(3)將所述的位相編碼切向偏振激發光折轉90°後進行消複色差聚焦，在螢光樣 品上得到衍射極限以下的激發光斑；(4)將用於抑制螢光樣品發出螢光的受激發射損耗雷射(即STED雷射)轉換為切 向偏振STED雷射；(5)將切向偏振STED雷射折轉90°後，與所述的位相編碼切向偏振激發光匯合且 同軸，再進行消複色差聚焦，在螢光樣品上聚焦形成中心點與激發光斑中心點重合的麵包 圈狀的聚焦光斑；(6)調整STED雷射的工作功率以抑制激發光斑邊緣的發光，使得聚焦在螢光樣品 上的激發光斑中僅有中心點發射出螢光，激發光斑中發光點的面積縮小達到IOOnm以下的 超高解析度；(7)收集發光點發出的螢光，在濾去背景噪聲和背景雜散光後，探測得到螢光光 強；(8)移動用於固定螢光樣品的納米平移臺對螢光樣品掃描並探測相應的螢光光 強，再經數據處理後得到超高解析度的顯微圖像。所述的切向偏振激發光或位相編碼切向偏振激發光優選為進行中心遮擋濾光後 的環狀光束。步驟(3)和(5)中，所述的聚焦通過消複色差高數值孔徑聚焦透鏡實現，所述的高 數值孔徑通常為NA = 1 1. 4，優選為NA = 1. 4。
步驟(1)中，將激發光轉換為切向偏振激發光通過偏振轉換器來實現。步驟(2)中，0 2 π渦旋位相編碼通過渦旋分布的0 2 π位相板(VortexO 2 31 Phase Plate)來實現。步驟(7)中，可通過將螢光透過窄帶濾光器來濾去背景噪聲，再聚焦到針孔上濾 去背景雜散光。本發明還提供了一種用於實現上述基於切向偏振的超分辨螢光顯微方法的裝置， 包括用於發出激發螢光樣品產生螢光的激發光的第一光源；用於將所述的激發光轉換 為切向偏振激發光的第一切向偏振轉換器；用於將切向偏振激發光進行0-2 π渦旋位相編 碼的渦旋分布的0 2 π位相板(Vortex 0 2 π PhasePlate)；用於將位相編碼切向偏振 激發光進行90°折轉的第一分光鏡；用於發出抑制螢光樣品發出螢光的STED雷射的第二光源；用於將所述的STED激 光轉換為切向偏振STED雷射的第二切向偏振轉換器；用於將切向偏振STED雷射進行90° 折轉的第二分光鏡；用於將經第一和第二分光鏡折轉後匯合的同軸光聚焦到螢光樣品上得到中心發 光點的消複色差透鏡，由於兩束同軸光聚焦在螢光樣品上的同一點，激發光產生衍射極限 以下的實心螢光發射光斑，STED雷射產生一個麵包圖形狀的空心螢光抑制光斑，兩光斑中 心點完全重合，實心螢光發射光斑與空心螢光抑制光斑重合部分的螢光發射被抑制，因此 實心螢光發射光斑只有中心點發射螢光成為發光點；用於收集和探測發光點發出的螢光並根據探測到的螢光光強獲得超高解析度的 顯微圖像的探測成像系統，所述的探測成像系統包括用於收集發光點發出的螢光的消復 色差透鏡、用於濾去收集的螢光信號中背景噪聲和背景雜散光的濾波器、用於對濾波後的 螢光信號進行探測的探測器、用於對探測得到的螢光光強進行處理和成像的成像器件；用於固定螢光樣品的納米平移臺，通過移動納米平移臺對螢光樣品進行掃描，從 而獲得二維顯微圖像。通過對螢光樣品進行三維掃描，可以獲得三維顯微圖像。本發明裝置中，所述的第一和第二光源可以為通用的產生準直雷射的光源，優選 使用雷射器。本發明裝置中，所述的第一和第二切向偏振轉換器可以為現有技術中實現切向偏 振光的轉換的任何器件與裝置，如由微結構光柵與幹涉儀組成的空間光調製器等，優選為 瑞典(ARCoptix)公司的偏振轉換器 Radial-Azimuthal Polarization Converter，可直接 將其它偏振光轉換為切向偏振光。本發明裝置中，所述的渦旋分布的0 2 π位相板(Vortex 0 2 π PhasePlate) 為厚度沿角向逐漸增加到一個光的波長量級所對應的相位為2π的位相板。所述的渦旋分 布的0 2 π位相板(Vortex 0 2 π Phase Plate)，對入射光的位相延遲量Δ α由如下
公式決定
△a = φ式中，為位相板平面上位置極坐標矢量與χ軸的夾角。所述的渦旋分布的0 2 π位相板(Vortex 0 2 π Phase Plate)優選採用美國RPC photonics公司的渦旋位相板(Vortex 0 2 π Phase Plate) VPP-1A，實際上也可採用 用作0 2 π渦旋操作的空間光調製器來實現相同的功能。本發明裝置中，所述的消複色差透鏡優選為高數值孔徑消複色差透鏡，所述的高 數值孔徑NA = 1 1. 4。高數值孔徑消複色差透鏡進一步優選為1. 4ΝΑ, 100倍放大，具有 平場矯正功能；本發明裝置中，所述的納米平移臺採用高精度納米平移臺，優選為德國PI公司的 高精度納米平移臺；本發明裝置中，所述的濾波器包括窄帶濾光器和空間濾波器，所述的窄帶濾光器 用於窄帶濾波除去背景噪聲，可以根據所發螢光的範圍進行選取；所述的空間濾波器可以 採用光纖或針孔，優選採用針孔，將收集的螢光聚焦後通過空間濾波器除去背景雜散光，所 述的針孔大小可以根據共焦的原則確定。本發明裝置中，所述的探測器為單光子探測器，優選為高量子效率的雪崩二極體 單光子探測器。本發明裝置中，所述的第一和第二分光鏡優選採用二色鏡，可以使激發光和STED 雷射垂直折轉，而使螢光直接透過，這樣不需另外添加光學元件，發光點發出的螢光只需經 過激發螢光發射的光路中消複色差透鏡的接收，再依次透過兩個二色鏡即可收集完成。本發明中，利用一束切向偏振激發光在渦旋分布的0 2 π位相板的操作下，聚焦 得到衍射極限以下的聚焦光斑；利用另一束切向偏振STED雷射在螢光樣品相同位置上聚 焦為麵包圈，去抑制激發光斑邊緣的發光。由於切向偏振STED雷射特有的聚焦特性，它比 圓偏振光形成的麵包圈收斂更快，因此在相對較低的STED工作功率下，可以達到與已有技 術相同的解析度。綜合上述兩點優勢，在保證解析度的情況下，可以大大降低STED工作功 率，克服已有技術在STED工作功率過高方面的不足。本發明的工作原理如下將從兩個雷射器分別出射的激發光和STED雷射，分別通過兩個切向偏振轉換器 轉換為切向偏振光後，進一步將切向偏振激發光進行0 2 π渦旋位相編碼，打破原有的幹 涉場，使得匯聚光斑不出現中空現象，得到實心螢光發射光斑；將位相編碼切向偏振激發光 和切向偏振STED雷射調製為同軸出射光後，由高數值孔徑的消複色差透鏡聚焦在被測量 的螢光樣品上，由於激發光是一個衍射極限以下的實心光斑，STED雷射是一個麵包圈狀空 心光斑，兩光斑中心點完全重合，而麵包圈狀空心光斑抑制激發光斑邊緣的發光，因此兩光 斑重疊部分被抑制，只有中心點發射出螢光，可以實現螢光光斑的減小，解析度的提高；可 見，本發明採用切向偏振和進行0 2 π渦旋位相編碼的激發光，本身就能得到衍射極限以 下的聚焦光斑，實現了高解析度，而現有技術中採用圓偏振雷射直接聚焦(沒有任何位相 調製)作為激發光，不能將激發光聚焦到衍射極限以下；而且，本發明採用切向偏振STED光 不需要進行渦旋位相編碼，直接聚焦就能得到麵包圈光斑(空心光斑)，而其它STED偏振光 需要經過渦旋位相編碼聚焦後才會有麵包圈光斑。由於切向偏振STED雷射特有的聚焦特 性，它比圓偏振光形成的麵包圈收斂更快，因此在相對較低的STED工作功率下，可以達到 與已有技術相同的解析度。這樣一來，在保證解析度的情況下，可以大大降低STED工作功 率。本發明將光束偏振理論與高數值孔徑聚集理論結合起來，克服已有技術在STED工作功 率過高方面的不足。
相對於現有技術，本發明具有以下有益的技術效果在保證高解析度的情況下，大大降低了 STED的工作功率，從而降低樣品的漂白， 避免對樣品的損壞，克服了已有技術在STED工作功率過高方面的不足。此外，由於激發光和STED光都是切向偏振光，在高數值孔徑透鏡聚焦下，只有徑 向(X，y方向)分量，都沒有Z向(焦深方向)分量，而現有技術中其它偏振光在高數值孔 徑聚焦下，都會有三個方向分量(x、y、z)，難以區分，因此，本發明對螢光偏振特性的研究提 供了更好的手段。


圖1為本發明的基於切向偏振超分辨螢光顯微裝置示意圖；圖2為本發明中切向偏振光示意圖；圖3為本發明中渦旋分布的0 2 π位相板(Vortex 0 2 π Phase Plate)的示 意圖；其中，a為渦旋分布的0 位相板的橫向示意圖，b為渦旋分布的0 位相 板的立體示意圖；圖4為位相編碼切向偏振激發光與現有技術中其它偏振光經高數值孔徑消複色 差透鏡聚焦後焦平面上的光強剖面對比圖；圖5為切向偏振STED雷射與現有技術中其它位相編碼偏振光經高數值孔徑消復 色差透鏡聚焦後焦平面上的光強剖面對比圖；圖中第一雷射器1 ；第二雷射器2 ；第一切向偏振轉換器3、第二切向偏振轉換器6 ；渦 旋分布的0 2 π位相板4 ；第一二色鏡5 ；第二二色鏡7 ；高數值孔徑消複色差透鏡8 ；熒 光樣品9 ；納米平移臺10 ；窄帶濾光片11 ；消色差聚焦透鏡12 ；針孔13 ；探測器14 ；切向偏 振激發光Rl ；切向偏振STED光R2 ；切向偏振激發光和切向偏振STED光的匯合R23 ；收集到 的螢光信號R4。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例來詳細說明本發明，但本發明並不僅限於此。如圖1所示的一種基於切向偏振超分辨螢光顯微裝置，包括第一雷射器1、第二雷射器2、第一切向偏振轉換器3、第二切向偏振轉換器6、渦旋 分布的0 2 π位相板4、第一二色鏡5、第二二色鏡7、高數值孔徑消複色差透鏡8、納米平 移臺10、窄帶濾光片11、消色差聚焦透鏡12、針孔13和探測器14。第一切向偏振轉換器3和第二切向偏振轉換器6為瑞典(ARCoptix)公司的偏振 轉換器Radial-Azimuthal Polarization Converter，渦旋分布的0 2 π位相板4為美國 RPC photonics 公司的渦旋位相板(Vortex 0 2 π PhasePlate) VPP—1A。第一雷射器1發出用於激發螢光樣品9產生螢光的激發光，並經過第一切向偏振 轉換器3轉換為切向偏振激發光，切向偏振光的特點如圖2所示，每點的偏振方向都是沿著 切線方向，所有點的偏振方向構成一個渦旋。其中切向偏振光光束內每一點的光偏振方向 可由以下單位矩陣表示 式中，識為光束垂直Z軸剖面內位置極坐標矢量與X軸的夾角。再將切向偏振激發光通過渦旋分布的0 2 π位相板4，將光線調製為0 2 π渦 旋位相，光線變為位相編碼切向偏振激發光R1。渦旋分布的0 位相板4的主要原理 是使通過它的光束在不同位置產生不同的相位延遲以達到位相編碼的目的。如圖3所示是 渦旋分布的0 2 π位相板4的橫向示意圖和立體示意圖。渦旋分布的0 2 π位相板4 對入射光的位相延遲量Δ α由如下公式決定 式中，識為位相板平面上位置極坐標矢量與X軸的夾角。位相編碼切向偏振激發光Rl經過第一二色鏡5折轉90°，光線為R3。第二雷射器2發出用於抑制螢光樣品發出螢光的STED雷射，經過第二切向偏振轉 換器6轉換為切向偏振STED雷射R2，再經過第二二色鏡7折轉90°，與R3匯合成同軸光 線 R23。同軸光線R23經過高數值孔徑消複色差透鏡8，其中，激發光在高數值孔徑消複色 差透鏡8的像方焦平面上形成超分辨聚焦光斑(實心螢光光斑)，STED光在高數值孔徑消 複色差透鏡8的像方焦平面上形成麵包圈的聚焦光斑(空心光斑)。兩光斑中心點完全重 合。此處，高數值孔徑消複色差透鏡8採用NA = 1. 4的100Χ消複色差具有平場校正的顯 微物鏡，並且在物鏡的像方(物鏡聚焦光斑一側)使用折射率η = 1.518的浸沒油，目的是 為了使物鏡達到1. 4的數值孔徑，可以達到更好的聚焦效果。在這種情況下，R3和R2光束 在高數值孔徑消複色差透鏡8的像方焦平面上形成以幾何光學理想焦點為中心的聚焦光 斑。聚焦光斑附近的光束電場分布可以由如下公式計算得到
r-cos 爐
E(r2 ,φ2,ζ2) = iC J^ sin(6>)^, (θ,φ)^, φ)
sin ζζ> 0
^a{θ,φ)^ikniz1 cos0+r2^Q^φ式中，(r2，朽，ζ2)是以理想焦點位置為原點的柱坐標系，C為歸一化常數，A1為光束 R2或者R3光強分布參數,A2為數值孔徑消複色差透鏡8的結構參數。Δα為位相延遲量， 識為位相板平面上位置極坐標矢量與χ軸的夾角，i為虛數單位，k = 2 π / λ，n為介質折射 率，θ為消複色差透鏡後的聚焦光線與光軸的夾角。採用上述公式可以分別計算得到焦平 面上的光斑的大小。其中光束R3聚焦後為一微小實心光斑，其半高全寬在衍射極限以下。圖4為位相 編碼切向偏振激發光與現有技術中其它偏振光經高數值孔徑消複色差透鏡8聚焦後焦平 面上的光強剖面對比圖。由圖4可以得出本發明的位相編碼切向偏振激發光聚焦點半高全 寬最小，其半高全寬為0. 34個光波波長，在衍射極限0. 357個光波波長以下(這裡數值孔 徑都是NA= 1.4)。如再採用孔徑遮攔進一步優化，可以達到0. 26個光波波長的半高全寬， 所以，在沒有使用STED進行消光的條件下，就已經有衍射極限以下的高解析度。儘管用帶孔徑遮攔優化後的聚焦切向偏振光有旁瓣，但這些旁瓣是在半高全寬為半波長以外，利用 共聚焦的接收方式可以濾去半波長以外的影響，因此在這旁瓣對系統解析度不造成影響。 因此，利用切向偏振激發光可以實現衍射極限以下的聚焦。而切向偏振STED雷射R2聚焦後為一麵包圈的空心光斑，對激發光R3光斑邊緣部 分進行進一步消光，進一步提高系統解析度。本發明與以往技術不同的是，切向偏振STED 光不需要進行渦旋位相編碼，直接聚焦就能得到麵包圈光斑(空心光斑)，而其它STED偏振 光需要經過渦旋位相編碼再聚焦後才會有麵包圈光斑。圖5為切向偏振STED雷射與現有 技術中其它位相編碼偏振光經高數值孔徑消複色差透鏡8聚焦後焦平面上的光強剖面對 比圖。由圖5可以看出，徑向偏振與線偏振因為中心點能量不為零無法在STED顯微技術中 使用，而用在STED顯微技術中，本發明的切向偏振STED雷射的能量最高處比圓偏振光的能 量最高處更接近中心點。如果從圓偏振光和切向偏振STED雷射聚焦後的能量最高點到中 心能量最低點各作一條直線，可以發現切向偏振STED雷射下直線的斜率更陡峭(斜率的絕 對值更大)，這說明切向偏振STED雷射用作對激發光消光時的收斂比圓偏振光用作對激發 光消光時的收斂要快。也就是說在相同的功率條件下，切向偏振STED光對激發光的消光能 力更強，能得到更高的解析度。因此，在相同的解析度情況下，切向偏振光所需要的STED光 的工作功率更小，起到了降低STED光功率的效果。激發光R3經STED光R2調製後，激發螢光的面積大大縮小，達到直徑在IOOnm以 下，中心點發射的螢光經過上述同一高數值孔徑消複色差透鏡8收集，透過第一二色鏡5和 第二二色鏡7，再經過窄帶濾光片11濾波以濾去背景噪聲，並經消色差聚焦透鏡12聚焦到 針孔13上，螢光信號經過針孔13濾波進一步濾去背景雜散光後，透過針孔13入射到光電 探測器14上得到螢光樣品上某一點的螢光信號的螢光光強，再通過移動納米平移臺10對 螢光樣品掃描和對螢光強度後續數據處理，得到超高解析度的顯微圖像。
10
權利要求
一種基於切向偏振的超分辨螢光顯微方法，其特徵在於，包括以下步驟(1)將用於激發螢光樣品產生螢光的激發光轉換為切向偏振激發光；(2)對所述的切向偏振激發光進行0～2π渦旋位相編碼，得到位相編碼切向偏振激發光；(3)將所述的位相編碼切向偏振激發光折轉90°後進行消複色差聚焦，在螢光樣品上得到衍射極限以下的激發光斑；(4)將用於抑制螢光樣品發出螢光的STED雷射轉換為切向偏振STED雷射；(5)將切向偏振STED雷射折轉90°後，與所述的位相編碼切向偏振激發光匯合且同軸，再進行消複色差聚焦，在螢光樣品上聚焦形成中心點與激發光斑中心點重合的麵包圈狀的聚焦光斑；(6)調整STED雷射的工作功率以抑制激發光斑邊緣的發光，使得聚焦在螢光樣品上的激發光斑中僅有中心點發射出螢光，激發光斑中發光點的面積縮小達到超高解析度；(7)收集所述的發光點發出的螢光，在濾去背景噪聲和背景雜散光後，探測得到螢光光強；(8)移動用於固定螢光樣品的納米平移臺對螢光樣品掃描並探測相應的螢光光強，再經數據處理後得到超高解析度的顯微圖像。
2.如權利要求1所述的超分辨螢光顯微方法，其特徵在於，所述的切向偏振激發光或 位相編碼切向偏振激發光為進行中心遮擋濾光後的環狀光束。
3.如權利要求1或2所述的超分辨螢光顯微方法，其特徵在於，所述的步驟(3)和(5) 中的消複色差聚焦通過消複色差高數值孔徑聚焦透鏡實現。
4.如權利要求3所述的超分辨螢光顯微方法，其特徵在於，所述的高數值孔徑為NA= 1 1. 4。
5.如權利要求4所述的超分辨螢光顯微方法，其特徵在於，所述的高數值孔徑為NA=1. 4。
6.一種用於實現如權利要求1 5任一所述的超分辨螢光顯微方法的裝置，其特徵在 於，包括用於發出激發螢光樣品產生螢光的激發光的第一光源；用於將所述的激發光轉換為切 向偏振激發光的第一切向偏振轉換器；用於將切向偏振激發光進行0 2 π渦旋位相編碼 的渦旋分布的0 2 π位相板；用於將位相編碼切向偏振激發光進行90°折轉的第一分光 鏡；用於發出抑制螢光樣品發出螢光的STED雷射的第二光源；用於將所述的STED雷射轉 換為切向偏振STED雷射的第二切向偏振轉換器；用於將切向偏振STED雷射進行90°折轉 的第二分光鏡；用於將經第一和第二分光鏡折轉後匯合的同軸光聚焦到螢光樣品上得到中心發光點 的消複色差透鏡；用於收集和探測發光點發出的螢光並根據探測到的螢光光強獲得超高解析度的顯微 圖像的探測成像系統；以及用於固定螢光樣品的納米平移臺。
7.如權利要求6所述的裝置，其特徵在於，還包括用於對切向偏振激發光或位相編碼切向偏振激發光進行中心遮擋濾光形成環狀光束的光闌。
8.如權利要求6所述的裝置，其特徵在於，所述的消複色差透鏡為高數值孔徑的消復 色差透鏡，所述的高數值孔徑NA = 1 1. 4。
9.如權利要求8所述的裝置，其特徵在於，所述的高數值孔徑NA=1.4。
全文摘要
本發明公開了基於切向偏振的超分辨螢光顯微方法，包括將切向偏振激發光進行0～2π渦旋位相編碼聚焦，在螢光樣品上得到衍射極限以下的激發光斑；調整使切向偏振STED雷射與位相編碼切向偏振激發光匯合且同軸，在螢光樣品上聚焦形成中心點與激發光斑中心點重合的麵包圈狀的聚焦光斑；調整STED雷射的工作功率，使激發光斑中發光點的面積縮小達到超高解析度；收集發光點發出的螢光，探測處理後得到超高解析度的顯微圖像。本發明還公開了用於實現上述基於切向偏振的超分辨螢光顯微方法的裝置。本發明中，在保證高解析度的情況下，大大降低了STED的工作功率，從而降低樣品的漂白，避免對樣品的損壞。
文檔編號G02B21/00GK101907766SQ20101022501
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月9日 優先權日2010年7月9日
發明者劉旭, 匡翠方, 王婷婷, 郝翔 申請人:浙江大學