一種自組裝短肽及其在細胞三維培養中的應用的製作方法

2023-05-27 11:43:51

一種自組裝短肽及其在細胞三維培養中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種自組裝短肽及其在細胞三維培養中的應用，該自組裝短肽命名為GFS-2，其胺基酸序列為SEQ ID NO.1。實驗表明，本發明所述自組裝短肽能夠自組裝形成納米纖維支架，支撐多種細胞生長，可以在納米生物醫學領域，作為細胞三維培養的基質材料。
【專利說明】一種自組裝短肽及其在細胞三維培養中的應用

【技術領域】
[0001]本發明屬於納米生物醫學領域，具體是一種自組裝短肽。

【背景技術】
[0002]分子自組裝指的是分子在不受外力介入的情況下，能夠進行自我組織，自我聚集形成一種規則的結構，即能夠從一個雜亂無序的狀態轉變成一個有序的狀態。在最近的十幾年裡，分子自組裝系統(如胺基酸)已經成為分子生物學、化學以及材料學等學科的交匯點，尤其是手性自組裝短肽，已經發展成為了一類新興的納米生物材料。由它們構成的納米纖維，作為細胞三維培養的基質材料，能模擬生物體內的三維基質微環境，具有高純度、可降解及無免疫反應的突出優點，已被成功應用於細胞工程、組織工程及生物醫學工程等領域。


【發明內容】

[0003]本發明的目的在於提供一種新型的自組裝短肽，增加自組裝短肽的種類，使之可在細胞三維培養中使用。
[0004]在手性自組裝短肽的設計原則下，本發明採用全新理念設計新型自組裝短肽，記為GFS-2，研究了濃度和離子對GFS-2自組裝過程的影響、低濃度自組裝短肽GFS-2對細胞膜的裂解作用、高濃度自組裝短肽GFS-2形成的納米纖維對細胞的活性的影響及細胞在該水凝膠中的生長、增殖情況等。
[0005]為了實現上述目的，本發明採用的技術方案是:一種自組裝短肽，其胺基酸序列為SEQ ID N0.1，命名為GFS-2。其分子量為1783.06。其自組裝原理是通過分子之間非共價鍵相互作用，形成結構明確且穩定，並具有某些理化性質的超分子結構或分子聚集體。
[0006]進一步，本發明還提供了自組裝短肽在細胞三維培養中的應用。
[0007]更具體地，所述自組裝短肽在製備細胞三維培養納米支架材料中的應用。
[0008]實驗表明，本發明所述短肽在金屬鹽離子、細胞培養基等環境下，能進行自組裝形成納米纖維。
[0009]實驗表明，本發明所述自組裝短肽形成的納米纖維，細胞能在其上進行三維黏附、生長，所以，此自組裝短肽可應用到動、植物細胞三維培養中。
[0010]本發明具有以下有益效果:
1、提供了一種新型自組裝短肽，增加自組裝短肽類型。
[0011]2、提供了一種新型的自組裝納米生物醫學材料，這種新型生物醫學材料能夠廣泛的應用到納米生物醫學工程、細胞工程及生物工程及等領域，並具有明顯的經濟及其社會效益。
[0012]3、提供了一種細胞三維培養納米支架材料，可廣泛應用於生物醫學領域。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是本發明所述L型胺基酸構成的自組裝短肽GFS-2的分子結構示意圖。
[0014]圖2是本發明所述自組裝短肽GFS-2高效液相(HPLC)色譜圖。
[0015]圖3是本發明所述自組裝短肽GFS-2質譜(MS)圖。
[0016]圖4是本發明所述自組裝短肽GFS-2的圓二色譜圖，新型短肽GFS-2常溫下的二級結構特徵是在216nm處有一強負峰，在194nm處有一強正峰，峰形完好。
[0017]圖5是本發明所述自組裝短肽GFS-2的原子力顯微圖(AFM)，圖中:A表示4h時短肽GFS-2自組裝形成細而短的納米纖維絲；B表示8h後納米纖維的長度增加，數量增多，並開始聚集；C表示48h後的AFM照片表明，納米纖維能完成自組裝過程，形成三維的納米纖維網絡支架。
[0018]圖6是本發明所述自組裝短肽GFS-2形成水凝膠光學圖片，剛果紅染色，5mg/mL的短肽GFS-2鹽離子溶液自組裝24h(圖6中A)後形成肉眼可見的透明膠狀物質，形成鬆散的片層狀薄膜；36h(圖6中B)薄膜的厚度及大小都有所增加，但還是處於鬆散的狀態；48h (圖6中C)薄膜片層連接在一起，形成整個一層較為緻密的膜片；72h(圖6中D)該膜片沒有明顯的變化。
[0019]圖7是本發明所述自組裝短肽GFS-2的紅細胞裂解實驗數據圖。
[0020]圖8是用本發明所述自組裝短肽GFS-2三維培養細胞，細胞ECA109 (圖8中A為20倍鏡；圖8中B為40倍鏡)和MDA-231 (圖8中C為20倍鏡；圖8中D為40倍鏡)都可以該三維體系中可以生長，細胞圓球形，邊界清楚，調節顯微鏡能看到模糊的細胞核界限，連續培養7d,細胞仍可以在本發明所述自組裝短肽GFS-2形成的三維支架材料中生長。

【具體實施方式】
[0021 ] 實施例1:由L-胺基酸構成的自組裝短肽GFS-2的製備
1、材料
Fmoc-L-Ala-OH (9-荷甲氧羰醯基-L-丙氨酸)、Fmoc-L-Leu-OH (9-荷甲氧羰醯基-L-亮氨酸)、Fmoc-L-Val-OH (9-荷甲氧羰醯基-L-糹顏氨酸)>Fmoc-L-Asp (OtBu) -OH (荷甲氧羰醯基L-天冬氨酸-ε -叔丁氧羰醯基)、Fmoc-L-Glu (OtBu)-OH(9-芴甲氧羰醯基-L-穀氨酸- ε-叔丁氧羰醯基)、Fmoc-L-Lys (Boc) -OH (9_荷甲氧羰醯基-L-賴氨酸-ε -叔丁氧羰醯基)、Fmoc-L-Arg (pbf) -OH (9-芴甲氧羰醯基-L-精氨酸-Y -叔丁氧羰醯基)、HBTU (O-苯並三唑-1-基-N、N、N、N-四甲基尿六氟磷酸脂)和HOBT (1_羥基苯並三氮唑);哌啶，乙酸酐，溶劑:DMF (N、N-二甲基甲醯胺)、TFA (三氟乙酸)、DCM (二氯甲烷)、NMM (N-甲基嗎啉)。
[0022]2、合成方法
稱取0.5mmol/g樹脂20g於肽合成器中，用DCM浸泡樹脂5_10分鐘後，再用400mlDMF清洗樹脂5次，每次清洗時間為3min，抽濾乾洗滌液。經過10-20分鐘用20%的六氫吡啶脫保護後，400mlDMF清洗樹脂5次，每次清洗3min，抽濾乾洗滌液。然後向反應器中加入原料(胺基酸，縮合劑等)縮合反應30分鐘，用DMF清洗5次，每次清洗3min，抽濾出洗滌液。按上述方式再進行保護一清洗一縮合一清洗一保護一清洗一抽乾，TFA切割，乙醚沉澱切割液，清洗2-3次後，抽乾，得到粗肽。HPLC純化後，冷凍乾燥，即得本發明所述的自組裝短肽GFS-2，其胺基酸序列為SEQ ID N0.1所示。
[0023]3、純化步驟
(O首先將上述得到的粗肽進行樣品的10-100%分析，在確定出主峰的保留時間後，線性梯度分析樣品；
(2)去離子水和乙腈(4:1)能夠較充分的溶解試樣品多肽；
(3)200mg多肽置於1ml的溶解瓶中，加入去離子水,經過超聲溶解後,用0.45 μ m的有機相濾頭過濾，取上清液；
(4)收峰由線性梯度製備，並確定MS是否正確；
(5)為了符合純度要求的液體量，要對所收的液體進行純度的跟蹤反饋；
(6)在40°C下，把所收集合格的溶液濃縮至40-50ml；
(7)濃縮好的溶液置於10ml燒杯中，放置於冰櫃中冷凍；
(8)乾燥;
(9)稱量；
(10)反打；
(11)包裝。
[0024]實施例2:短肽GFS-2的高效液相色譜和質譜檢測與三維分子模型繪製
對實施例1製備的短肽GFS-2採用普通畫圖軟體(Hyperchem 7.5, www.hyper, com)繪製得到分子結構示意圖，見圖1，由圖可看出胺基酸的空間分布。
[0025]將實施例1製備的短肽GFS-2利用高效液相色譜(HPLC)檢測，參見圖2，由圖2中的譜峰面積可計算其純度已達到95%。將實施例1製備的短肽GFS-2採用質譜(MS)檢測，參見圖3，說明其分子量為1783.06是正確的。
[0026]實施例3:自組裝短肽GFS-2的圓二色性檢測和原子力顯微鏡(AFM)檢測
用去離子水配製100 μ M短肽GFS-2溶液，圓二色譜儀(AVIV 400⑶spectrometer)對短肽GFS-2進行⑶檢測，參數設置:掃描波長為190-260nm，光徑為2mm。本發明短肽GFS-2常溫下的二級結構特徵是在216nm處有一強負峰，在194nm處有一強正峰，峰形完好(見圖4)。這一結果表明，新型短肽GFS-2具有穩定的β-sheet 二級結構，在特定的條件下發生自組裝，形成納米纖維。
[0027]用生理鹽水配製500 μ M的短肽GFS-2溶液，在室溫下讓短肽自組裝48小時，分別在4、8和48h時製作樣本。在新撕開的雲母片上滴加10 μ I短肽溶液，靜置60s，再用Iml去離子水衝洗3次，吸乾雲母片上的水分，將含有檢測樣品的雲母片置於超淨的工作檯上，自然晾乾後，用原子力顯微鏡觀察，掃描模式為敲打模式。4h時短肽GFS-2自組裝形成細而短的納米纖維絲；8h後納米纖維的長度增加，數量增多，並開始聚集；48h後的AFM照片表明，納米纖維能完成自組裝過程，形成三維的納米纖維網絡支架(見圖5)。
[0028]實施例4:用短肽GFS-2的剛果紅染色實驗及自組裝形態和效果
用生理鹽水配製5mg/ml短肽GFS-2溶液，在25°C下孵育24到72小時。取10 μ I水凝膠塗抹在載玻片上，用剛果紅液染色30s，在光鏡下觀察(結果見圖6)。5mg/mL的短肽GFS-2鹽離子溶液自組裝24小時後形成肉眼可見的透明膠狀物質，形成鬆散的片層狀薄膜；36h薄膜的厚度及大小都有所增加，但還是處於鬆散的狀態；48h薄膜片層連接在一起，形成整個一層較為緻密的膜片；72h該膜片沒有明顯的變化。72h後自組裝短肽GFS-2形成的水凝膠含水量可高達99%，成透明狀的膠體，離心管倒置後，該凝膠不會下滑。
[0029]實施例5:用自組裝短肽GFS-2對細胞裂解實驗
(O分別用生理鹽水和去離子水配製不同濃度(1、10、100μ g/ml)的短肽溶液。
[0030](2)取Sprague Dawleg (SD)大鼠(200_250g，雌雄隨機，重慶醫科大學動物中心提供，手術過程遵守動物實驗國家標準)新鮮凍存血液(EDTA抗凝)，1500r離心20min，將白細胞層及其血漿層全部移除，用生理鹽水洗2-3次，取紅細胞4滴，加入10ml生理鹽水中，配製成4%紅細胞溶液(RBC)。
[0031](3)取100 μ I短肽溶液和400 μ 1RBC，400 μ I生理鹽水，加入離心管中，在37°C條件下孵化I小時後，5000r離心15min，取上清液。
[0032](4)用分光光度計在570nm波長下檢測吸光度。
[0033](5)陽性對照組加入紅細胞裂解液，陰性對照組加入生理鹽水。
[0034]數據表明，3種不同濃度的短肽溶液對紅細胞的裂解度相近，與陽性對照組比較相差0.340左右，與陰性對照組相差0.015左右，且裂解度都不超過0.060 (〈0.100)(見圖7)。這一結果說明3種不同濃度的短肽GFS-2溶液對細胞膜都不具有裂解作用，且自組裝24h以後的短肽溶液與未組裝前對細胞膜的作用相似。
[0035]實施例6:用短肽GFS-2對細胞三維培養
分別配製所需濃度的自組裝短肽溶液與ECA109和MDA-231細胞(重慶醫科大學分子與腫瘤醫學實驗室贈送)懸液，取等體積的短肽溶液、細胞懸液混合均勻，按照每孔50μ I的方式滴加到96孔板中，靜置lOmin，再加入培養基連續培養I周。細胞增殖實驗用CCK-8檢測，採用酶標儀測試。
[0036]細胞三維培養的操作如下:
(1)將實施I製備的自組裝短肽GFS-2配製成各濃度溶液(2.5,3.5,4.5,5.5,6.5、7.5mg/ml)，取適量(100-300 μ I)移入離心管中備用；
(2)培養好的ECA109和MDA-231細胞分別用0.25%胰酶消化，再移入離心管中，1000rmp/min離心沉澱細胞lOmin，棄上清液，加入蔗糖溶液(質量濃度為20%)記數到細胞5X 15個/ml，分別取300 μ I備用；
(3)在離心管中快速混合(I)和(2)中的溶液，得短肽和細胞的混合液；
(4)取(3)中的混合液50μ I滴加到96孔板中；
(5)滴加RPM1-1640完全培養基20μ 1，自組裝5 — 1min ；
(6)滴加RPM1-1640完全培養基150μ I，放在細胞培養箱培養30 — 60min ；
(7)取出一半的細胞培養孔板液體，加入等體積的新鮮的RPM1-1640的完全培養基，換液完畢後，置於細胞培養箱繼續培養2-5天。
[0037]經典二維細胞培養作為陰性對照，倒置顯微鏡顯示ECA109和MDA-231細胞呈不規則形態，邊界清晰，外觀近似梭形。運用GFS-2自組裝形成的納米纖維作為三維支架材料培養細胞，發現細胞ECA109和MDA-231都可以在該三維體系中生長，細胞圓球形，邊界清楚，調節顯微鏡能看到模糊的細胞核界限(見圖8)。當短肽GFS-2濃度為5.5mg/mL時，ECA109和MDA-231細胞24-72h時生長較緩慢，72h後細胞增長加快；在GFS-2三維支架中，兩種細胞初期的生長速度不及正常二維細胞培養組(陰性對照)。連續培養7d，仍可見細胞在GFS-2形成的三維支架材料中生長，且形態良好(見圖8)。該結果表明ECA109和MDA-231細胞可在GFS-2形成的三維支架中生長，且生長形態良好。
【權利要求】
1.一種自組裝短肽，其特徵在於:其胺基酸序列為SEQ ID N0.1。
2.根據權利要求1所述一種自組裝短肽，其特徵在於:所述自組裝短肽的分子量為1783.06。
3.權利要求1或2所述自組裝短肽在細胞三維培養中的應用。
4.權利要求1或2所述自組裝短肽在細胞三維培養中的應用，其特徵在於:所述自組裝短肽在製備細胞三維培養納米支架材料中的應用。
5.根據權利要求3或4所述自組裝短肽在細胞三維培養中的應用，其特徵在於:所述細胞為動物細胞或植物細胞。
【文檔編號】A61L27/38GK104497107SQ201410739523
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月8日 優先權日:2014年12月8日
【發明者】羅忠禮, 嶽媛媛, 陳振銀, 李萌萌, 徐曉帆, 孫悅霖, 趙天鑫 申請人:重慶醫科大學