一種哺乳動物胚胎的體外處理方法及在胚胎移植中的應用的製作方法

2023-05-27 00:22:46 4

專利名稱：：一種哺乳動物胚胎的體外處理方法及在胚胎移植中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種哺乳動物胚胎的體外處理方法及在胚胎移植中的應用，本發明尤其是涉及一種牛的胚胎體外處理方法及在胚胎移植中的應用。技術背景胚胎是通過將一頭良種母畜配種後的早期胚胎取出，或者通過體外受精及其它方式獲得的胚胎。胚胎移植是指將胚胎移植到同種的、生理狀態相同的母畜體內，使之繼續發育成為新個體的繁殖技術。動物胚胎移植首次試驗成功距今已有ioo餘年，但長期以來並未用於畜牧生產，直到20世紀70年代中期才作為提高母畜繁殖的一種技術和家畜育種、胚胎工程的手段而得到實際應用。胚胎在發育早期的一段時間內(附植之前)，在輸卵管和子宮內處於游離狀態，和子宮還沒有建立實質性的聯繫，因此可以脫離母體而被取出，在短時間內和適當的條件下仍能夠存活，當放回到與供體相同的環境中，能夠繼續發育。所謂附植是指哺乳動物囊胚滋養層細胞與母體子宮上皮細胞之間逐步建立組織和生理上聯繫的過程，其作用是為胎兒以後的發育提供充足的營養。胚胎發育早期一直處在透明帶中，除了保護早期胚胎，透明帶在受精過程中起著十分重要的作用，精-卵的種屬特異性識別及結合必須發生在透明帶表面的受體上，倘若這些受體一旦被遮蓋或改變了性質，則精-卵識別及結合便無法進行。胚胎發育到擴張囊胚後，透明帶變薄，擴張囊胚進一步發育，逐漸從透明帶中脫出來，此時的透明帶就只是一個胚胎的附屬物，如果胚胎不能突破透明帶反而會阻礙胚胎著床，好多IVF(體外受精)胚胎因無法突破透明帶，到發育後期就凋亡了。從透明帶中脫出的囊胚稱為孵化囊胚，這一階段的胚胎細胞分化為兩類，即外周的滋養層細胞和內層的內細胞團細胞。滋養層細胞能選擇吸收外界的營養物質，供胚胎發育需要。滋養層細胞將來主要發育為胎盤的絨毛膜，內細胞團細胞進一步分化，最終形成胎兒。囊胚在孵化過程中或孵化以後發出妊娠信號，與母體子宮建立初步聯繫。胚胎移植可以充分發揮優良母畜的繁殖潛力，提高繁殖效率，代替種畜的引進，同時也是育種工作的有效手段。'另一個與現有胚胎移植技術相關聯的問題是，由於常規胚胎移植技術的妊娠率僅為40%左右,所以使該方法的使用受到了限制
發明內容本發明的目的是提供一種牛的胚胎體外處理方法，此方法克服了常規方法的上述問題，此種方法可使牛的胚胎的移植妊娠率提高20%。在達到上述目的過程中，本發明提供了一種牛的胚胎的體外處理方法，此法包括(1)選擇良種母牛作為供體，在發情周期的6~15天，每頭牛注射PG0.4~0.6mg,進行同期發情處理，於發情後的9~12天注射FSH，每天早、晚各注射一次，逐次遞減，總劑量為10mg，在第12天注射FSH的同時注射PG0.4~0.6mg,供體牛發情後進行人工授精，於供體牛發情配種後的68天，釆用常規非手術法衝胚。將獲得的胚胎經冷凍-解凍後移植或直接移植鮮胚，胚胎移植前將透明帶進行打口。(2)透明帶打口處理胚胎移植前，在培養皿中用培養液(PBS+10穿BS或Holding)做成100nL的液滴，將待處理的胚胎放入培養液滴中，利用顯微作業系統的Holding針固定住胚胎，在胚胎的透明帶與內細胞團之間，用打口針沿內細胞團水平切線處穿入透明帶，然後用打口針輕輕挑破透明帶，使透明帶上形成一個10士2nm-30土2]Lim的微口；或者在體視顯微鏡下，用微型刀片在胚胎的透明帶上徒手切割一個10±2nm-30±2nm的微口。(3)將經過處理的胚胎移植到牛的子宮內。附圖為胚胎透明帶打口示意圖。l為胚胎的透明帶，位於胚胎的最外層，2為胚胎內細胞團，3為Holding針，利用其負壓將胚胎固定，4為打口針，用於胚胎在透明帶上打口。用Holding針3將胚胎固定後，在胚胎的透明帶1與內細胞團2之間，用打口4針沿內細胞團2水平切線處穿入透明帶1，然後用打口針4輕輕挑破透明帶l。這樣就在胚胎透明帶l上形成了一個微口。具體實施方式從以下實施例將進一步理解本發明。實施例1:取30枚牛的胚胎，在培養皿中用培養液(PBS+10%FBS或Holding)做成100jaL的液滴，將待處理的胚胎放入培養液滴中，利用顯微作業系統Holding針固定胚胎，在胚胎的透明帶與內細胞團之間，用打口針沿內細胞團水平切線處穿入透明帶，然後用打口針輕輕挑破透明帶，使透明帶上形成一個IO士2jam的微口；或者在體視顯微鏡下，用微型刀片在胚胎的透明帶上徒手切割一個10±2|Lim的微口。經處理後的胚胎分別移植到30頭受體牛的子宮內，60天後用獸用B超機觀察受體牛的受孕情況。另取31枚牛的胚胎，分別直接移植到31頭受體牛的子宮內，60天後用獸用B超機觀察受體牛的受孕情況。兩組對照妊娠結果見表l。tableseeoriginaldocumentpage5實施例2:重複實施例l,有以下不同點,試驗組胚胎透明帶微口大小為20±2nm。兩組對照妊娠結果見表2。tableseeoriginaldocumentpage5實施例3:重複實施例l，有以下不同點,試驗組胚胎透明帶微口大小為30土2)im。兩組對照妊娠結果見表3。tableseeoriginaldocumentpage6有益效果以上結果表明，胚胎移植前，在胚胎的透明帶上打一個微口,可使其移植妊娠率提高20.4%。權利要求1.一種哺乳動物胚胎的體外處理方法，包括(1)在培養皿中用培養液(PBS+10％FBS或Holding)做成100μL的液滴，將待處理的胚胎放入培養液滴中；(2)利用顯微作業系統的Holding針固定住胚胎，在胚胎的透明帶與內細胞團之間，用打口針沿內細胞團水平切線處穿入透明帶，然後用打口針輕輕挑破透明帶，使透明帶上形成一個微口；(3)或者在體視顯微鏡下，用微型刀片在胚胎的透明帶上徒手切割一個微口。2.權利要求1所述的哺乳動物胚胎體外處理方法為在胚胎移植中的應用。3.權利要求1所述的哺乳動物胚胎體外處理方法為牛的胚胎體外處理方法。4.權利要求2所述的胚胎移植中的應用為牛的胚胎移植中的應用。5.權利要求1所述的微口大小為10±2pm-30±2]um。全文摘要本發明涉及一種哺乳動物胚胎的體外處理方法及在胚胎移植中的應用，尤其是涉及一種牛的胚胎體外處理方法及在胚胎移植中的應用。該技術將哺乳動物的胚胎放在PBS+10％FBS或Holding培養液滴中，利用顯微作業系統Holding針固定胚胎，用打口針在透明帶上打一個10±2μm-30±2μm的口；或者在體視顯微鏡下，用微型刀片在透明帶上打一個10±2μm-30±2μm的口，使其更容易著床，從而提高胚胎的移植妊娠率。文檔編號C12N5/06GK101386838SQ20071014543公開日2009年3月18日申請日期2007年9月12日優先權日2007年9月12日發明者孟令會,李兆元,李敘浩,李雪松申請人:廊坊開發區聖隆生物科技有限公司