釀酒酵母基因缺失菌株在清除環境水質中重金屬的應用的製作方法

2023-05-26 23:00:56

釀酒酵母基因缺失菌株在清除環境水質中重金屬的應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種釀酒酵母基因缺失菌株的應用，屬於環境治理【技術領域】。其提供的三個基因的缺失菌株可以應用於搖瓶和發酵罐或其它培養器裡，為構建用於鎘汙染環境治理的高效吸收和去除鎘離子的環境工程應用奠定基礎。這種篩選過程規模大，效率高，篩選出的菌株切實提高了重金屬鎘的吸收能力。
【專利說明】釀酒酵母基因缺失菌株在清除環境水質中重金屬的應用【技術領域】
[0001]本發明涉及一種釀酒酵母基因缺失菌株的應用，屬於環境治理【技術領域】。
【背景技術】
[0002]鎘是一種有毒的重金屬環境汙染物。空氣中的鎘主要來自家庭或工業產生的廢氣、汽車尾氣、金屬加工行業、電池或油漆製造業以及廢物的處理過程。鎘可以從汙染源地隨著空氣傳播，汙染食物或水質。菸葉本身可以積累較高濃度的鎘，因而吸菸是鎘汙染的重要來源之一。近來的流行病學案例研究進一步證實鎘具備致癌性。肺癌、前列腺癌、胰腺癌和腎癌的發生都與長期接觸鎘有關。隨著我國工業的發展，近年來發生了多次大面積的鎘汙染事件，包括2005年的廣東北江鎘汙染，2009年的湖南瀏陽鎘汙染，2011年的雲南曲靖鎘汙染和2012年的廣西龍江鎘汙染事件。這給我國環境造成了極大的壓力。
[0003]釀酒酵母(Saccharomyces cere visiae)是重要的發酵工業微生物，且被認定為GRAS (Generally Regarded as Safe)生物，因此被廣泛研究用於重金屬生物吸附材料。通過功能基因組學手段，我們篩選到釀酒酵母基因組中與鎘離子耐受性相關的基因，闡明參與鎘主動吸收和代謝的途徑及其調控機理，為構建用於鎘汙染環境治理的高效吸收和去除鎘離子的酵母工程菌株奠定基礎。

【發明內容】

[0004]本發明的目的在於提供一種釀酒酵母缺失菌株，在清除環境水質中鎘方面的應用，還公開了一種大規 模高效篩選耐受鎘基因的方法，並得到了三個對鎘離子敏感而且對鎘離子吸收能力顯著增加的基因缺失菌株，為構建用於鎘汙染環境治理的高效吸收和去除鎘離子的酵母工程菌株奠定基礎。
[0005]按照本發明提供的技術方案，釀酒酵母基因缺失菌株在清除環境水質中重金屬的應用，三株釀酒酵母基因缺失菌株，應用於去除環境水質中的重金屬。
[0006]所述重金屬為重金屬鎘。
[0007]所述三株釀酒酵母基因缺失菌株分別缺失#招2、CYS3和CYS4三個基因；其中MIDI基因缺失菌株，其分類命名為Saccharomyces cereFisae,對應缺失的基因序列如SEQID N0.1所示,CU基因缺失菌株,其分類命名為cererisae,對應缺失的基因序列如SEQ ID N0.2所不基因缺失菌株,其分類命名為cerevisae,對應缺失的基因序列如SEQ ID N0.3所示。
[0008]從美國Invitrogen Inc公司購買同源的以BY4743為母菌株的4600個單基因缺失菌株出發，進行篩選:在添加IOOmM鎘的YPD固體培養基上對菌株進行培養24-48小時，發見midl、cys3、cys4三株菌株對鎘敏感。進而對它們吸收鎘能力進行測定，發現這三株菌株對鋪的吸收能力提聞。
[0009]本發明的有益效果:本發明提供的三個缺失菌株可以應用於搖瓶和發酵罐裡，用於水質中鎘的高效吸收和去除鎘離子的環境工程。這種篩選過程規模大，效率高，篩選結果切實獲得了鎘的吸收能力增加的菌株。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1實施例2中各基因缺失菌株和野生型釀酒酵母菌株細胞內鎘離子含量測定圖。A:野生型菌株BY4743、i/ii/#、漢和#招7基因缺失菌株；B:野生型菌株BY4743、
和基因缺失菌株。
【具體實施方式】
[0011]實施例1菌株的篩選
a、初步篩選。用已滅菌的384針接菌器將釀酒酵母缺失株文庫(從美國InvitrogenInc公司購買)中的菌株影印到YPD+100 mM CdCl2的培養基上，同時在YB)培養基上影印一次(作為對照)。平板在 30°C生化培養箱中培養2-3天後，拍照記錄結果。通過與YPD培養基上菌株的生長結果對比，找出YPD+100 mM CdCl2培養基上有生長缺陷的菌株，既為鎘離子敏感候選菌株。
[0012]YPD培養基:酵母提取物10g/L，蛋白腖20g/L，葡萄糖20g/L。
[0013]b、通過倍比稀釋(梯度稀釋)方法對鎘離子敏感候選菌株進行驗證。從釀酒酵母缺失株文庫中挑取鎘離子敏感候選菌株，在YPD平板上活化後，接種到YPD液體培養基中過夜培養。將菌株過夜培養物用無菌水按10倍依次稀釋至10的-4次方，然後從每個稀釋濃度中取3mL分別點在YPD+100mM CdCl2和YPD平板上，30°C培養2天後觀察生長情況，拍照，記錄實驗結果。與YPD平板上菌株的生長情況相比，確定對100 mM CdCl2敏感的基因缺失菌株。
[0014]最終，從釀酒酵母缺失株文庫中共發現106個基因缺失菌株對鎘離子敏感，其中包括#招7、CYS3和CYS4三個基因的缺失菌株。
[0015]實施例2原子吸收法測定釀酒酵母缺失株胞內鎘離子濃度
a、活化菌株。在YPD平板上活化菌株{MID1、CYS3和CYS4\
[0016]b、挑取單菌落(2mm直徑的菌落一個)接於YPD液體培養基中過夜培養24h，基本達到飽和。
[0017]C、將過夜培養物分別轉接到新的50 mL液體YPD+CdCl2 (50 μ Μ)液體培養基中，使初始OD吸光度值達到0.2，30°C培養4h。
[0018]d、樣品處理:
(I)將步驟c的最終培養物2000g離心2 min。
[0019](2)用冰上預冷的10 mM MgCl2溶液(含IM sorbitol山梨糖醇)洗細胞三次，用重懸和離心的方法。
[0020](3)洗好的細胞重懸於5 mL 10 mM MgCl2溶液中(不含sorbitol)。
[0021](4)取0.3mL步驟(3)所得的細胞重懸液加入步驟(2)所得的2.7 mL IOmM的MgCl2溶液中，混勻後測OD 660nm吸光度值；10 mM MgCl2溶液做空白對照。
[0022](5)加入濃 H2SO4 (10M)至終濃度 0.5% (50 mM)，95°C水浴放置 IOmin。
[0023](6)離心，取上清，用原子吸收光譜法測定相應金屬離子濃度。
[0024]經原子吸收法檢測，結果表明MID1、CYS3和67貨基因的缺失菌株吸收鎘的能力和野生型釀酒酵母菌株相比分別提高了 11倍、9倍和7倍以上，而其它兩個對照基因缺失菌株菌株,來自以上從美國Invitrogen Inc公司購買的釀酒酵母缺失株文庫)沒有區別，如圖1 所示。Y坐標為各個菌株細胞胞內鎘離子含量。BY4743為野生型菌株對照，cys3和cys4為鎘吸收能力和野生型菌株沒有顯著差異的兩株基因缺失菌株。
【權利要求】
1.釀酒酵母基因的缺失菌株在清除環境水質中重金屬的應用，其特徵是:三株釀酒酵母基因缺失菌株，經培養後應用於去除環境水質中的重金屬。
2.如權利要求1所述釀酒酵母基因缺失菌株在清除環境水質中重金屬的應用，其特徵是:所述重金屬為重金屬鎘。
3.如權利要求1所述釀酒酵母基因缺失菌株在清除環境水質中重金屬的應用，其特徵是:所述三株釀酒酵母基因缺失菌株分別缺失#/見、67幻和67貨三個基因；其中#招7基因缺失菌株對應缺 失的基因序列如SEQ ID N0.1所示，基因缺失菌株對應缺失的基因序列如SEQ ID N0.2所示，CYS4基因缺失菌株對應缺失的基因序列如SEQ ID N0.3所示。
【文檔編號】C02F3/34GK103951089SQ201410199132
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月12日 優先權日:2014年5月12日
【發明者】蔣伶活 申請人:江南大學