控制地老虎害蟲的方法

2023-06-06 11:18:41 2

專利名稱：控制地老虎害蟲的方法
控制地老虎害蟲的方法
對相關申請的交叉參照本申請要求1999年8月23日提交的美國臨時專利申請系列號60/150，319的優先權。本
背景技術：
在造成農作物損失和使它們得以控制的花費方面，昆蟲和其它害蟲每年都要耗費農民幾十億美元。昆蟲在農業生產環境上造成的損失包括農作物產量的減少和農作物質量的降低。收穫成本的增加也是昆蟲大批出現的一個結果。昆蟲問題已部分地由栽培方法如莊稼輪作，以及由施肥刺激植物的狀根生長的高水平的磷酸鹽而解決。但是，莊稼輪作可被例如長角葉甲的出現兩年滯育(或越冬)性狀而破壞。化學殺蟲劑嚴重地依賴於保證所需的控制水平。化學殺蟲劑提供了控制害蟲的有效方法。但是，公眾已開始關注在食物、地下水和環境中其它地方發現的殘餘化學藥劑的數量。因而，越來越多的仔細審查合成的化學殺蟲劑的潛在的對環境不利的後果。某些合成化學殺蟲劑能夠毒化土壤和下面的蓄水層，作為流走物的結果汙染地表水，以及破壞非靶生物形式。某些合成化學控制藥劑進一步的缺點是，在用於寵物、家畜或兒童可能接觸到的區域時，成為公眾安全公害。它們還會對施藥的人產生健康損害，特別是他們沒有遵守正確的施藥方法時。世界上的管制機構正在限制和 /或禁止多種合成殺蟲劑的使用，特別是那些在環境中持續存在的和進入食物鏈的殺蟲劑。 對殺蟲劑使用的新的嚴格限制和從市場消除某些有效的殺蟲劑會限制控制花費很多的害蟲的經濟和有效的選擇。因為這些與使用多種合成化學殺蟲劑相關的問題，所以存在對限制這些藥劑使用和確定替代控制藥劑的明確需要。取代合成的化學殺蟲劑，或將這些殺蟲劑和生物殺蟲劑組合使用，能夠降低環境中的毒性化學劑。日益普及使用的生物殺蟲劑是土壤微生物蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis) (B. t.)。土壤微生物B. t.是革蘭氏陽性、形成芽孢的細菌。許多B. t.菌株不顯示殺蟲活性。有些B.t.菌株產生殺蟲的伴孢蛋白質包涵體。這種蛋白質包涵體在顯微鏡下常顯現為特殊形狀的晶體。晶體包涵體的形狀和類型可用於表徵B.t.菌株。在晶體包涵體中存在的典型的具有專一殺蟲活性的「 S -內毒素」與不具有專一宿主範圍的外毒素是不同的。B.t.殺蟲劑的商業使用起初限於小範圍的鱗翅目(毛蟲)害蟲。例如，蘇雲金芽孢桿菌庫斯塔克亞種(B. thuringiensis subsp. kustaki)的芽孢和晶體的製備物已經作為鱗翅目害蟲的商品殺蟲劑使用多年。但是最近，研究人員已發現對更廣範圍的害蟲具有專一性的B.t.殺蟲劑。例如，蘇雲金芽孢桿菌以色列亞種(B. t. israelensis)和莫裡遜(morrisoni)亞種已經作為商品分別用於控制雙翅目和鞘翅目昆蟲。(Gaertner， F. H. [1989] "Cellular Delivery of CropProtection :Living and Non-Living Microorganisms」在ConlrolledDelivery of Crop Protection Agents,R. M. ffilkins,ed., Taylor 禾口 Francis，New York 禾口 London，1990，pp. 245—255」 )。
已經鑑定了 B. t.的新亞種，並分離和測序了活性δ-內毒素蛋白質的基因 (Hofte, H.，H. R. ffhiteley[1989]Microbiological Reviews52(2) :242-255)。Hfifte 和Whiteley將B. t.晶體蛋白質基因分為四個主要種類。各種類為cryl (鱗翅目專一的)， cry11 (鱗翅目和雙翅目專一的)，cryl11 (鞘翅目專一的)，和cryIV(雙翅目專一的)。 已經報導了對其它害蟲有專一毒性的菌株(Feitelson, J. S.，J. Payne, L. Kim[1992]Bio/ Technology 10 :271-275)。例如，已建議用CryV和CryVI命名兩種新的線蟲-活性毒素。多種蘇雲金桿菌δ-內毒素蛋白質由兩個功能片段組成。這些「全長」蛋白質含有一個抗蛋白酶的核心毒素，對應於蛋白質分子的大約前半部分(N-末端部分)。已經知道了一種CryIIIA B. t. δ -內毒素核心片段的三維結構，並認為所有相關的毒素具有相同的整體結構(Li, J. , J. Carroll, D. J. Ellar[1991]Nature 353:815-821)。分子的第二半部分(C-末端部分)通常稱為「前毒素片段」。相信前毒素片段參與毒素晶體的形成(Arvidson, H. , P.Ε.Dunn, S. Strand, Α. I. Aronson[1989]Molecular Microbiology 3 1533-1534 ；Choma, C. Τ. , W. K. Surewicz, P. R. Carey, Μ. Pozsgay, Τ. Raynor, H. Kaplan [1990] Eur. J. Biochem. 189 :523-527)。在昆蟲腸內，典型的由蛋白酶將全長的130kDa毒素分子加工成抗性核心片段。因而前毒素片段可能通過降低蛋白酶對毒素分子的加工(Haider， Μ. Ζ.，B. H. Knowles, D. J. Ellar[1986]Eur. J. Biochem. 156 :531-540)或降低毒素溶解性 (Aronson, Α. I. , Ε. S. Han, W. McGaughey, D. Johnson[1991]Appl. Environ. Microbiol. 57 981-986)限制核心對昆蟲的可及性從而賦予毒素部分昆蟲專一性。HSfte和Whiteley在1989年的命名和分類方案基於毒素的推斷的胺基酸序列和宿主範圍。該系統適於覆蓋14種不同類型的毒素基因並將其分為五個主要類別。一種建議的修改的命名方案僅基於胺基酸一致性(Crickmore等[1996]Society for Invertebrate Pathology,29th Annual Meeting, IIIrd International Colloquium on Bacillusthuringiensis, University of Cordoba, Cordoba, Spain, Septemberl-6,1996, abstract) 0除了仍為單獨的一類的cytA和cytB之外，在所有的這類毒素中保留了記憶性的「cry」。在第一等級中將羅馬數字變為阿拉伯數字，除去了第三等級中的括號。當前的範圍代表了 95% (第三等級)、75% (第二等級)和48% (第一等級)的序列一致性。雖然數字已重新劃分，仍然保留了許多原始命名。亦可參看「Revisionsof the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis PesticidalCrystal Proteins,，，N. Crickmore, D. R. Zeigler, J.Feitelson, E.Schnepf, J. Van Rie, D.Lereclus, J. Baum,禾口 D. H. Dean, Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol. 62 :807-813 -MR Crickmore, Zeigler, Feitelson, Schnepf, Van Rie, Lereclus, Baum,禾口 Dean, "Bacillus thuringiensis toxinnomenclature，，(1999)http://www, biols. susx. ac. uk/Home/Neil Crickmore/Bt/index. html。該系統使用可自由獲取的應用軟體CLUSTAL W和PHYLIP。 PHYLIP軟體包中的NEIGHBOR應用程式使用算術平均(UPGMA)算法。分離新的B. t.分離物和它們的毒素基因，以及測定毒素的精確殺蟲範圍，是一個緩慢的經驗的過程。隨著廣泛的研究和物力投資，發布了新B. t.分離物、毒素、基因以及已知B.t.毒素和分離物的新用途的專利。作為綜述參看前面i^itelson等的文章。但是發現新的B.t.分離物以及已知B.t.分離物和毒素的新用途仍然是經驗性的，不可預知的技術。
Smulevitch 等([1991]FEBS Lett. 293 :25-26)，Gleave 等([1991]JGM 138 55-6 ，和Schevelev等([1993]FEBS Lett. 336 :79-82)描述了對鱗翅目昆蟲有針對活性的 Cry9 毒素的特徵。Lambert 等(Lambert, B.，A. Van Vliet, Μ. Peferoen[1996]Appl. Environ. Microbiol 62(1) :80-86)以及公布的 PCT 申請 W094/05771 和 W094/2似64 中也描述了對鱗翅目害蟲有針對活性的B. t.分離物和Cry9C毒素。美國專利號5，126，133 ;5，188,960 ；和5，691，308公開了一個來自B. t.分離物 PS81I 的 CrylFa 毒素和基因(81IA)。美國專利號 5，527，883 ；5，508，264 ；5，827，514 ；和 5，840,5 涉及CryIF嵌合毒素。W099/24581公布了多種植物最優化的CrylF基因。美國專利號5，686，069公布了來自B. t.分離物PS91C2的Cryli^b毒素和基因。使用基因工程技術，正在開發多種向農業環境施用B. t.毒素的方法。早在15年之前，在公開文獻中已描述了在大腸桿菌(E.coli)中克隆和表達B. t.晶體蛋白質基因 (Schn印f，H. Ε.，H. R. Whiteley [1981]Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 :2893-2897)。美國專利號4，448，885和美國專利號4，467，036均公開了 B. t.晶體蛋白質在E. coli中的表達。 已經產生了基於-重組DNA的B. t.產品並已獲準使用，包括利用B. t.基因遺傳工程操作植物以實現抗昆蟲，以及使用穩定化的微生物細胞作為B. t.蛋白質傳遞載體。通過修飾 B. t.毒素和/或其基因獲得了多種改進。例如，美國專利號5，380，831和5，567，862涉及在植物中有增進表達的合成的殺昆蟲晶體蛋白質基因的產生。因而，分離的B. t.內毒素基因成為有商業價值的。B. t.毒素在農業中的成功應用的困難包括昆蟲對B. t.毒素產生的抗性。此外，某些昆蟲是B. t.的作用難以控制的。後者包括諸如棉鈴象坪和地老虎，迄今證實它們對多數 B. t. δ-內毒素無明顯敏感性。地老虎發育進度中有多個作為幼蟲的齡期。雖然較後齡期幼蟲咬噬幼苗產生最明顯的損害和經濟損失，但食葉通常造成農作物諸如玉米的減產。在接近晚期齡期時(例如第三至四齡)，幼蟲開始咬噬植株或植株部分，特別是幼苗。由於進食方式的改變，在極少早期警告信號的情況下能夠不可預見地形成造成經濟損失的種群。大的地老虎每天可破壞數株幼苗，並且嚴重的害蟲侵襲可除去整個群叢的農作物。地老虎的夜間習慣和向地下挖洞的行為也使觀測和治理很成問題。/Jn Mk ^ !Μ (The black cutworm) (Agrotis ipsilon (Hufnagel) ； M g (Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae))是多種農作物包括玉米、棉花、十字花科芸苔屬蔬菜(白菜(Brassica)，青花椰菜，甘藍，大白菜)以及草坪的嚴重害蟲。次級宿主植物包括甜菜根，辣椒，鷹嘴豆，faba beans，萵苣，紫花苜蓿(lucerne)，洋蔥，馬鈴薯，蘿蔔，油菜，水稻，大豆，草莓，甜菜，菸草，番茄，以及森林樹木。在北美洲，地老虎屬(Agrotis)的害蟲以苜蓿，玉米(corn)，菸草，大麻，洋蔥，草莓，黑莓，覆盆子，紫花苜蓿(alfalfa)，大麥，豆類，甘藍，燕麥，豌豆，馬鈴薯，紅薯(sweetpotatoes)，番茄，花園花卉，草，紫花苜蓿 (Iucern)，玉米(maize)，蘆筍，葡萄，幾乎所有類型的葉子、野草和許多其它農作物和花園植物為食。在地老虎種群(the Tribe Agrotini)中的其它地老虎是害蟲，特別是那些 Feltia 屬(例如 F. jacul if era (Guenee)；相當於 ducens subgothica)禾口 Euxoa 屬(諸如 E. messoria(Harris), Ε.scandens(Riley), Ε.auxiliarisSmith, Ε. detersa(Walker), Ε. tessellata(Harris)), Ε· ochrogaster (Guenee))。諸如 Peridroma saucia 的地老虎也可以是重要害蟲。柑橘類的植物也可能是地老虎攻擊的目標(「柑橘地老虎」Xylomyges curialis是一個例子)。地老虎也是北美洲以外地區的害蟲，較具經濟重要性的害蟲攻擊鷹嘴豆，小麥， 蔬菜，甜菜(sugarbeet)，紫花苜蓿，玉米，馬鈴薯，蕪箐，油菜，萵苣，草莓，羅甘莓植物， 亞麻，棉花，大豆，甜菜根(beetroot)，大白菜，番茄，茄子，甘蔗，牧草，甘藍，落花生，葫蘆 (Cucurbita)，蕪菁，向日葵，白菜(Brassica)，洋蔥，韭菜，芹菜，芝麻，蘆筍，大黃，菊苣，溫室農作物，以及菠菜。小地老虎(A. Ipsilon)是北美洲以外，包括中美洲，歐洲，亞洲，澳大利亞，非洲，印度，臺灣，墨西哥，埃及和紐西蘭出現的害蟲。阿根廷的主要地老虎品種是灰緣地夜蛾(Agrotis malefida), Porosagrotis gypaetiana，和小地老虎(Agrotis ipsilon (亦拼寫為ypsilon))。這些地老虎攻擊例如玉米，大豆和向日葵等培育植物，這些昆蟲可嚴重減少幼苗種群，而且在有些情況下，可完全破壞整塊土地。對小地老虎(A. ipsilon)的培養控制諸如周邊野草控制可以幫助防止嚴重的侵襲；但是，這種方法不是總能適用或有效。侵襲是散發性的，並且在種植前或種植時施用殺蟲劑在過去是無效的。存在控制農作物中地老虎的一些誘餌。為了保護草皮草諸如 ere印ingbentgrass，使用了化學殺蟲劑。因為公眾與這些區域的緊密接觸，在草皮-覆蓋區(例如高爾夫球草地，運動場，公園和其它娛樂區域，專業景觀美化以及家庭草坪)使用化學殺蟲劑受到特別的關注。天然產物(例如線蟲和印苦楝子素(azadirachtin))通常效果不佳。今天，由於迄今為止缺乏充分的效果，蘇雲金芽孢桿菌產品控制小地老虎沒有得到廣泛應用。地老虎的迅速取食和挖洞的行為使它們特別難以使用目前生物基礎的害蟲溶液來控制。例如CrylA(b)毒素對地老虎是基本無效的。本發明的簡要總結本發明涉及令人驚訝的發現，CrylF蛋白質具有抗地老虎例如小地老虎(Agrotis ipsilon)的活性。這樣，本發明提供了控制這些害蟲的方法，其中上述方法包括將上述害蟲與殺蟲劑量的至少含有CrylF毒素的殺虫部分的蘇雲金桿菌毒素接觸。因此，本發明包括使用全長、截短和嵌合的CrylF蛋白質和基因。在優選實施例中，CrylF毒素是Cryli^a 毒素。可以按照本發明使用野生型和合成的CrylF蛋白質。這樣，本發明包括使用與已知 CrylF基因，優選的是核心毒素(core-toxin)編碼部分雜交的多核苷酸(和/或它們的互補物，優選的是其全長互補物)。在優選的實施方案中使用了植物-最優化的多核苷酸。本發明包括使用轉基因宿主，包括植物宿主諸如玉米、棉花和向日葵。在一個優選實施方案中，本發明涉及用本發明的至少一種多核苷酸轉化的植物細胞，從而使轉化的植物細胞在目標昆蟲消耗的組織中表達殺蟲蛋白質。這種植物的轉化可以通過使用本領域熟練技術人員熟知的技術來完成，並且典型的可包括修飾該基因來優化毒素在植物中的表達。附圖的簡要描述


圖1顯示第四齡小地老虎幼蟲感染後和不同的處理後M小時完整小麥幼苗的質量和相對損傷程度級別。圖2顯示第三齡小地老虎幼蟲感染後48小時和不同的處理後小麥幼苗的鮮重。
圖3和圖4圖示了實施例4中討論的結果。序列的簡要描述序列1是全長的、植物-最優化的CryIF/CryIA(b)雜合基因的多核苷酸序列，該基因命名為1F1AB-P0。序列2是全長的、植物-最優化的CryIF/CryIA (b)嵌合毒素的胺基酸序列。 1F1AB-P0基因編碼該毒素。序列3是截短的、植物-最優化的cryIF基因的多核苷酸序列，該基因命名為 1F-T-P0。序列4是截短的、植物-最優化的cryIF毒素的胺基酸序列。命名為1F_T_P0、 1F-7G-P0和1F-7Z-P0的基因編碼該毒素。序列5是命名為SlIA(CryIFa)的野生型、全長B. t.毒素基因的天然多核苷酸序列。序列6是命名為SlIA(CryIi^a)的全長、野生型B. t.毒素的胺基酸序列。序列7是命名為1F-7G-P0的在棉花中最優化表達的基因多核苷酸序列。序列8是命名為1F-7Z-P0的在玉米中最優化表達的基因多核苷酸序列。未發明的詳細公開本發明涉及令人驚訝的發現，CrylF蛋白質具有抗地老虎例如小地老虎的活性。更令人驚訝的是發現本發明的毒素和基因可以控制第三齡或以上的幼蟲。控制第一齡和第二齡的地老虎幼蟲遠非控制更晚齡期那麼重要。儘管已知CryI毒素一般是有抗鱗翅目活性的，但通常認為地老虎對B. t.毒素有抗性，如前面背景部分所祥述。本發明包括使用重組宿主和提供植物最優化的(plant-optimized)多核苷酸序列。這些多核苷酸序列包括命名為1F1AB-P0、1F-T-P0、1F-7G-P0和1F-7Z-P0的植物最優化的基因。優選的植物宿主包括穀物(corn)、大豆、棉屬、小麥、canola和向日葵。本發明的一些實施方案中，基因編碼與全長CrylF毒素相比截短的CrylF毒素。本發明截短的毒素典型地缺失全部或部分的前毒素節段。並且，本發明截短的基因可用於產生嵌合的基因和蛋白質。一個實施例是含有一個cryIF部分和一個crylA(b)部分的植物最優化的基因，其中雜合基因編碼一種嵌合毒素。優選的嵌合基因和毒素公布於美國專利號5，527，883和5，840，554中。根據本發明可以使用的其它嵌合基因和毒素公布於美國專利號5，508，264和5，827，514中。在一個優選實施方案中，嵌合基因的cryIF部分本身就是殺害蟲的。也可依據本發明使用融合毒素。在一個優選實施方案中，本發明涉及用至少一種多核苷酸序列轉化的植物細胞， 從而使轉化的植物細胞在靶昆蟲消耗的組織中表達殺蟲毒素，進而使害蟲接觸殺蟲蛋白質。這種植物的轉化可以通過本領域熟練技術人員熟知的技術來完成，並且典型地可包括修飾該基因來優化毒素在植物中的表達。對本技術領域熟練人員顯而易見的是，給出此處列出的基因序列，可以通過多種方法獲得本發明的基因。在優選實施方案中，例如可以使用基因合成儀構建該基因。也可以按照本發明的教導通過修飾(例如通過點突變技術)來自如下所述保藏在培養物保藏處的某些分離物的野生型基因來獲得此處例示的特定基因。例如可以從B. t.分離物PS81I獲取野生型cryIF基因。同樣，本發明的雜合基因的crylA(b)部分可以通過合成或修飾野生型基因來獲得。CryIA(b)毒素和基因已經描述於例如H6f te等(1986)Eur. J. Biochem. 161 273 ；Geiser 等(1986)Gene 48 :109 ；以及Haider 等(1988)Nucleic Acids Res. 16 10927。 對於克隆和其它野生型分離物，在上面的標題為「本發明背景」中和下面的列表中有詳細討論。本申請討論的培養物已經按照布達佩斯協議保藏在農業研究機構保藏中心 (Agricultural Research Service Patent CultureCollection (NRRL))，Northern Regional Research Center，1815North University Street， Peoria， Illinois 61604，
USA。下面列舉的保藏的菌株，在如上標題為「本發明背景」中所述的專利參考中公開。
傳代培養物編號保藏日期B. t. PS81INRRL B-184841989年4月19日E.coli (NM522) (PMYC1603) (81IA)NRRL B-185171989年6月30日應當理解可獲得保藏物並非授權實踐本發明，從而損害政府授予的專利權。基因和毒素可以使用本發明的多核苷酸形成完整「基因」在所需宿主細胞中編碼蛋白質或多肽。例如，本技術領域熟練人員很容易認識到，所附的序列列表中有些多核苷酸沒有顯示終止密碼子。並且，如本領域可容易的認識到，可以將本發明的多核苷酸置於目的宿主中的啟動子控制下。如熟練人員所容易的認識到，DNA典型的以雙鏈形式存在。在這種排列中，一條鏈與另一條鏈互補，反之亦然。由於DNA在植物中複製(例如)產生了 DNA的其它的互補鏈。 這樣，本發明包括對附錄的序列表中例示的多核苷酸及其互補鏈的使用。本領域常使用「編碼鏈」指與反義鏈結合的鏈。為了在體內表達蛋白質，典型將DNA的一條鏈轉錄為一條mRNA 的互補鏈，它作為模板翻譯出蛋白質。mRNA實際上是從DNA的「反義」鏈轉錄的。「有義」或 「編碼」鏈有一系列密碼子(密碼子是三個核苷酸，一次讀三個可以產生特定胺基酸)，其可作為開放閱讀框(ORF)閱讀來形成目的蛋白質或肽。本發明還包括與例示的DNA有相當功能的RNA和PNA(肽核酸)。可以例如使用寡核苷酸探針來鑑定、獲取和表徵本發明的基因和毒素。探針是可檢測的核苷酸序列。本發明特別例示的多核苷酸或其部分足以編碼活性毒素，它們自身可用作探針。探針可以是DNA、RNA或PNA(肽核酸)。這些序列可以通過合適的標記，包括或可固有地產生螢光得以檢測，例如國際專利號W093/16094中所述。如本領域熟知，如果探針分子和核苷酸樣品通過在兩個分子間形成強鍵雜交，有理由假定探針和樣品實質上是同源的。優選的，通過本技術領域熟知的技術在嚴緊的條件下進行雜交，例如Keller，G. H.，Μ. M Manak(1987)DNA Probes, Stockton Press,New York,NY. ,pp. 169-170 中所述。例如，如此處所說，高嚴緊的雜交條件可以如下獲得，首先在室溫下用h SSC(標準檸檬酸鹽)/0. 1% SDS(十二烷基磺酸鈉)洗15分鐘。典型的洗兩次。更高的嚴緊性可以通過降低鹽濃度和 /或提高溫度來實現。例如，上述雜交步驟可以隨後在室溫下用0. Ix SSC/0. SDS洗15 分鐘，依次可隨後在55°C用0. Ix SSC/0. SDS洗30分鐘。本技術領域會知道，這些步驟
8使用的溫度也可以用於此處討論的其它方案(例如用SSPE取代SSC)。可以將50ml 20x SSC和5ml 10% SDS加入到445ml水中製備h SSC/0. 1% SDS0 20x SSC可以通過將氯化鈉(175. 3g/0. 150M)、檸檬酸鈉(88. 2g/0. 015M)和水混合為1升，然後用ION氫氧化鈉將 PH調節到7.0來製備。10% SDS可以通過將IOg SDS溶於50ml高壓滅菌水，稀釋到IOOml 並分成等份。檢測探針提供了一種方法，以已知的方式確定是否發生雜交。這種探針檢測提供了鑑定本發明編碼毒素的基因的快速方法。可以使用DNA合成儀和標準程序合成本發明中用作探針的核苷酸片段。此處使用的雜交的「嚴緊」條件是指達到與當前申請使用條件相同或近似相同程度的雜交專一性的條件。特別地，使用標準方法進行Southern印跡中固定化DNA與 32P-標記的基因-專一探針的雜交(Maniatis，Τ.，Ε. F. Fritsch, J. Sambrook[1982] MolecularCloning :A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, NY) 0通常，在能夠檢測靶序列的嚴緊條件下進行雜交和隨後的洗滌。對於雙鏈 DNA基因探針，在DNA雜合體熔解溫度(Tm)下20-25 °C在6x SSPE,5x Denhardt溶液， 0. 1% SDS,0. lmg/ml變性DNA中過夜進行雜交。熔解溫度由下列公式確定(Beltz, G. Α.， K. A. Jacobs, Τ. H. Eickbush, P. Τ. CherbasjP F. C. Kafatos [1983]Methods of Enzymology, R. Wu, L. Grossman 禾口 K. Moldave[eds. ]Academic Press, New York 100 :266-285)。Tm = 81. 5°C +16. 6Log[Na+] +0. 41 (% G+C) -0. 61 (% 甲醯胺)-600/雙鏈鹼基對長度。典型的如下進行洗滌(1)在室溫下Ix SSPE, 0. 1 % SDS中洗滌15分鐘共兩次(低嚴緊洗滌)。(2)在Tm-20°C下0. 2x SSPE，0. 1 % SDS中洗滌15分鐘一次(中等嚴緊洗滌)。對於寡核苷酸探針，在雜合體熔解溫度(Tm)下10-20°C在6xSSPE，5x Denhardt溶液，0. 1% SDS, 0. lmg/ml變性DNA中過夜進行雜交。寡核苷酸探針的Tm由下列公式測定Tm (°C ) =2 (T/A 鹼基對數)+4 (G/C 鹼基對數)(Suggs, S. V. , Τ. Miyake, Ε. H. Kawashime, Μ. J. Johnson, K. Itakura, 禾口 R. B. Wallace[1981]ICN-UCLA Symp. Dev. Biol. UsingPurified Genes, D. D. Brown[ed.], Academic Press, New York, 23 :683-693)。典型的如下進行洗滌(1)在室溫下Ix SSPE, 0. 1 % SDS中洗滌15分鐘，共兩次(低嚴緊洗滌)。(2)在雜交溫度下Ix SSPE, 0. 1 % SDS中洗滌15分鐘一次(中等嚴緊洗滌)。基因和毒素的修飾本發明中使用的基因和毒素不但包括特定的例示序列，還包括保存了此處特別例示的蛋白質的殺蟲活性特徵的部分和/或片段(包括與全長蛋白質相比在內和/或末端缺失)、變體、突變體、取代物(有替代胺基酸的蛋白質)、嵌合體和融合蛋白。此處使用的術語基因的「變體」或「變異」是指編碼同一毒素或編碼有殺蟲活性的等價毒素的核苷酸序列。此處使用的術語「等價毒素」是指與權利要求的毒素具有相同或基本相同的抗靶害蟲的生物活性的毒素。使用標準技術可以修飾基因和容易的構建基因變異體。例如，本領域熟知製造點突變的技術。又例如美國專利號5，605，793描述了在隨機斷裂後使用DNA重裝配產生其它分子多樣性的方法。可以使用商品化核酸內切酶製造全長基因的片段，並且可以按照標準程序使用核酸外切酶。例如，可以使用酶諸如Bal31或定點誘變從這些基因的末端系統地切除核苷酸。還可以使用多種限制性酶獲取編碼活性片段的基因。可以使用蛋白酶直接獲得這些毒素的活性片段。使用此處提供的教導可以從B. t.分離物和/或DNA文庫衍生出等價毒素和/或編碼這些等價毒素的基因。有多種方法獲取本發明的殺蟲毒素。例如，可以使用此處公開和要求保護的殺蟲毒素的抗體從蛋白質混合物鑑定和分離其它毒素。特別地，抗體可能是由毒素最恆定和與其它B. t.毒素最不同的毒素部分引起的。然後可以通過免疫沉澱、酶聯免疫吸附測定(ELISA)或western印跡方法使用這些抗體專一的鑑定有特徵活性的等價毒素。可使用本領域標準程序容易的製備此處公開的毒素或等價毒素或這類毒素的片段的抗體。然後可以從微生物中獲得編碼這些毒素的基因。由於遺傳密碼子的豐餘性，多種不同的DNA序列可以編碼相同的胺基酸序列。產生這些編碼相同或基本相同的毒素的可替代DNA序列正在本領域訓練的人員技術水平內。 這些不同的DNA序列包括在本發明的範圍內。此處使用的「基本上相同的，，序列是指有胺基酸取代、缺失、添加或插入但實質上不影響殺蟲活性的序列。本定義中亦包括保留殺蟲活性的片段。等價毒素與例示的毒素有胺基酸相似性(和/或同源性)。胺基酸類似性/相同性典型的大於60 %，優選的大於75 %，更優選的大於80 %，甚至更優選的大於90 %，並且可以大於95%。也可以根據更特定的相同性和/或類似性範圍定義本發明的優選的多核苷酸和蛋白質。例如與此處例示的序列有百分之49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、 61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、 86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99的相同性和/或類似性。除非特別說明， 如此處使用的兩個核酸之間的序列相同性和/或類似性百分數是使用Karlin和Altschul 的算法確定的(1990)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :2264-2268,改進的方法見 Karlin 和 Altschul (1993)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873_5877。這種算法併入到 Altschul 等 (1990)，J. Mol. Biol. 215 :402-410 的 NBLAST 和 XBLAST 程序中。使用分數(score) = 100、 字長度(wordlength) = 12的參數通過NBLAST程序進行BLAST核苷酸檢索，以獲得有所需序列相同百分數的核苷酸序列。為了比較的目的獲得有缺口的比對，使用了 Altschul等 (1997) Nucl. Acids Res. 25 :3389-3402 中所述的 Gapped BLAST 程序。使用 BLAST 和 Gapped BLAST程序時，使用了各程序(NBLAST和XBLAST)的預設參數。參看網址http://www. ncbi. nih. ROV0也可以使用上面背景部分中所述的Crickmore等的方法和算法計算相同性分數。在決定生物活性的或參與確定最終決定生物活性的三維構型的毒素的關鍵區域， 胺基酸同源性最高。在這點上，如果取代發生在對活性非關鍵的區域或是不會影響分子的三維構型的保守胺基酸取代，則這些胺基酸取代是可接受的和能夠期望的。例如，胺基酸可以分為以下類別非極性的，不帶電極性的，鹼性的和酸性的。只要取代本質上不影響化合物的生物活性，一個類別的某胺基酸被同一類別的另一個胺基酸替代的保守取代包括在本發明的範圍內。表1提供了屬於各種類的胺基酸的實例的列表。
權利要求
1.控制地老虎害蟲的方法，該方法包括將所述害蟲與和SEQIDNO :3具有至少95%同一性的殺蟲蛋白質毒素接觸。
2.權利要求1的方法，其中所述毒素是截短的毒素。
3.權利要求1的方法，其中所述毒素存在於產生該毒素的植物細胞中並且所述害蟲通過攝食所述植物細胞與所述毒素接觸。
4.權利要求1的方法，其中所述地老虎害蟲是Agrotis屬的。
5.權利要求1的方法，其中所述地老虎害蟲是Agrotisipsilon.
6.權利要求3的方法，其中所述框物是穀物作物。
7.權利要求3的方法，其中所述植物是向日葵屬植物。
8.權利要求3的方法，其中所述接觸步驟之前的步驟是播種含有編碼所述毒素的多核苷酸的植物的種子。
全文摘要
本發明涉及用於控制地老虎害蟲的方法和材料。在一個優選實施方案中，使用Cry1Fa蛋白質控制小地老虎。
文檔編號A01P7/04GK102246823SQ201110128090
公開日2011年11月23日 申請日期2000年8月23日 優先權日1999年8月23日
發明者B·A·斯託克霍夫, C·康蘭 申請人:麥考根公司