一種縮短北蟲草子實體生長周期的培育方法
2023-06-06 10:11:36 1
專利名稱：：一種縮短北蟲草子實體生長周期的培育方法
技術領域：
：-本發明涉及快速培養北蟲草子實體的方法，進一歩將是提供一種可以縮短北蟲草子實體生長周期的培育方法，屬於生物菌類培養方法
技術領域：
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背景技術：
：北蟲草(Cordycepsmilitaris)是指真菌的菌絲通過各種方法侵染鱗翅目昆蟲，以昆蟲體內的物質行寄生生活，通過不斷的發育和分解後最終伸出昆蟲體表，而形成的一種真菌與蟲體外殼共存的生物體。其主要功效成份蟲草素明顯高於冬蟲夏草。隨著人們生活水平的提高及保健意識的增強，做為保健、藥品主要原料之一的蟲草需求量R益增加，加之蟲草的採集，嚴重破壞了野生植被。蟲草屬國家明令禁止野外採集並加以保護的野生物種資源。為了滿足市場的需求，人工培養北蟲草已成為當前的發展趨勢。而目前國家普遍採用cordycepsmiltitaris菌株為北蟲草生產菌，該菌株在固體培養子實體的生長過程中存在著生長周期長，大約40d到50d左右，給生產管理及提高單位產量都帶來了一定的制約。
發明內容本發明提供一種可以縮短北蟲草子實體生長周期的培育方法,應用納米技術使植物生長素緩慢釋放，目的旨在快速高產培養固體北蟲草子實體，在保證北蟲草子實體的營養成份不變的基礎上縮短生長周期同時，將植物生長素的噴灑次數降至最低，從而提高北蟲草子實體的產量，減低勞動。本發明的技術解決方案包括以下操作歩驟1.北蟲草的培宵①馬鈴薯培養基②將北蟲草菌株接種於PDA斜面，26'C恆溫箱中培養7天，向斜面試管中注入無菌生理鹽水，振蕩後用無菌脫脂棉過濾，製成濃度約為3*107個/11^的孢子懸液。③栽培培養基85份大米+15份蛹粉，含水量65%，分裝於玻璃瓶內，121°C35分鐘滅菌備用。④用滅過菌的槍頭將制好的孢子懸液加入米飯培養基，每罐頭瓶培養基加2mL孢子懸液(孢子濃度為3"(^個/mL)，後用滅過菌的竹筷將米飯攪拌均勻，用封口膜封好，轉入培養室培養。溫度控制在23t:左右，空氣相對溼度為60%左右，黑暗培養，菌絲封底後室內增加散射光，培養料表面或四周有桔黃色色素形成，即進入子實體管理時期。⑤菌絲轉色完成後，為刺激子實體原基形成，增加光照和溫差刺激，每天光照不少於10h，溫度19-25°C，相對溼度60-80%，每天通風10min以補充新鮮空氣，蛹蟲草子座長出後，增加光照強度，在500-700lx的散射光照，溫度保持23'C左右，空氣溼度65%左右，每天通風換氣3次，每次10min。2.羥基磷灰石納米粒子一植物生長素製備及噴灑①溶液配置溶液A配製準確稱取無水乙酸鈣0.705g，加重蒸水定容至10ml，搖勻備用；溶液B配製準確稱取磷酸二氫銨1.381g,乙酸銨4.008g，加重蒸水45ml，用濃氨水調節pH值在7.6左右，補加重蒸水定容至50ml，搖勻備用；②羥基磷灰石納米粒子一植物生長素製備步驟l準確稱取赤黴素lmg，溶液B溶解，緩慢攪拌；步驟2將溶液A逐漸滴加到溶液B中，保持反應體系溫度在37±rC，pH值7.4±0.2之間，緩慢攪拌l小時；步驟3反應液4。C下10000rpm/min離心15分鐘；步驟4離心後沉澱室溫下乾燥48小時，4'C保存。③稱取羥基磷灰石納米粒子一植物生長素0.28，用水定容1000ml，備用。④在培養瓶培養大約7天左右，即己從營養生長階段向生殖生長階段過渡時，將0.1%的植物生長素噴灑在菌表面。由於羥基磷灰石納米粒子一植物生長素具有緩慢釋放作用，因此在北蟲草生活周期中只需要噴灑一次。⑤培養至26天左右，子實體可長高到8-9cm左右，即可下架採摘。為表明本發明的積極效果，通過以下單因素實驗(包括不同培養原料、培養基含水量、PH值和不同溫度、光照對子實體乾重及質量的影響)對北蟲草固體培養條件進行比較原料選擇不同的原料，複合原料均為9份大米+l份的其他原料(大米+蛹、大米、麥粒、玉米饈、大米+麥鼓、大米+豆粉)，每條件處理10瓶。計算平均產量，即子實體的乾重(g/瓶)。蛹粉濃度優化在原料優化的基礎上，進一步考察蛹粉不同濃度對栽培的影響，每條件處理10瓶。原料含水量選擇85份大米+15份蛹粉作為原料，每瓶固體原料40g，加不同體積的水設置不同含水量，每條件處理10瓶。pH值栽培原料為85份大米+15份蛹粉。用in/。NaOH和P/。HCl調節水的pH。使原料起始pH分別為3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5，每條件處理10瓶。溫度將接種的栽培瓶分別在23'C,暗恆溫培養至瓶底轉色後，分別置不同溫度，室內散射光培養出草，每條件處理10瓶。光照強度採用不同密度的遮陽網設置不同強度的光照，將黑暗發菌至瓶底轉色的栽培瓶，置不同光照下培養出草，每條件處理10瓶。實驗結果及討論1、不同栽培原料對蟲草生長的影響栽培原料對北蟲草生長影響很大，結果表明(表.l)，大米和大米複合原料所產了實體的綜合質量明顯好於其他原料；從產量上看，單一原料以大米為最好，平均每瓶(40g原料)產幹蟲草3.84g;複合原料以大米+蛹粉產量最高，平均每瓶(40g原料)產幹蟲草《76g。表1栽培原料對北蟲草生長的影響海瓶子實體乾重tableseeoriginaldocumentpage62、不同蛹粉濃度對北蟲草生長的影響由實驗可知，添加蛹酚可有效增加北蟲草子實體產量，在此基礎上進一步考察不同蛹粉濃度對蟲草生長的影響(結果見表2)。結果表明，蛹粉的濃度在5%-15%時蟲草栽培的子實體質量好，產量均有明顯的提高，15%時產量最高，子實體乾重為4.79g;濃度為25%時，表現出草遲緩，產量降低。表.2蛹粉不同濃度對北蟲草生長的影響/%_tableseeoriginaldocumentpage6子實體評價+++++++++++子實體產量/g4.394.644.794.421.023、不同原料含水量對北蟲草生長的影響含水量對蟲草子實體產量影響很大(表3)，以大米+蛹粉為原料栽培生產，分析實驗數據知含水量在65%時有較高的子實體產量，質量也好。表3原料含水量對北蟲草生長的影響含水量455055606570菌絲體發育周期/d333435353543子實體質量評價++++++++++++++子實體產量/g4.074.334.394.694.853.194、不同pH值對蟲草生長的影響以85份大米+15份蛹粉為原料栽培生產，含水量定為65%，從表4.4數據可知，蟲草對pH的適應範圍較廣，在原料起始pH在3.5-8.5均可生長出子實體，其最適宜pH為7.5。表4不同pH值對北蟲草生長的影響3.54.04.55.05.56.06.57.07.58.08.5子實體質量評價+++++++++++++++++++++++++子實體產量/g0.851.483.254.024.444.564.794.754.923.761.745、不同溫度對北蟲草生長的影響應用前面優化出的最佳條件培養，考察不同溫度變化對北蟲草子實體產量的影響。由表4.5知在溫度為13-27°〇範圍均可出草，23'C為蟲草最適溫度，此時北蟲草子實體乾重為4.93g。表5溫度對北蟲草生長的影響溫度1315171921232527子實體質量評價+++++++++++++++++++子實體產量/g1.952.863.424.224.734.933.841.426、不同光照強度對北蟲草生長的影響光照對北蟲草了實體的生長影響很大(表6)。黑暗處理不產生子實體；連續光照與問隔光照均能產生子實體；在500-700lx的散射光照處理的子實體產量最高。表6光照對北蟲草生長的影響tableseeoriginaldocumentpage8得到人工栽培北蟲草菌株的最優培養條件為原料為85份大米+15份蛹粉，原料的最適含水量為65%，子實體最適生長溫度為23°C;最適pH為7.5，黑暗培養不利於子實體生長，在500-7001x的散射光照時產量最高。7、噴灑赤黴素與不噴灑赤黴素北蟲草固體培養子實體效果比較製備羥基磷灰石納米粒子一赤黴素，可使赤黴素包裹在羥基磷灰石納米粒子孔徑中，起到緩慢釋放的作用，從而在整個北蟲草生長周期中，僅需噴灑羥基磷灰石納米粒子一赤黴素一次。分別在培養瓶培養大約7天，將羥基磷灰石納米粒子—赤黴素噴灑在菌表面；繼續在培養室內進行培養，直至子實體生長己有2cm高左右時，在子實體表面噴灑一次。表7噴灑赤黴素對北蟲草固體培養子實體有效成分的有效成分tableseeoriginaldocumentpage8在北蟲草子實體生長過程中添加植物生長素後，培養時間縮短14天左右。菌絲體在PH6.5—一7.5時生長較快。產量可增加1/3左右(即原來可生產100公斤情況下，噴灑赤黴素好後生產130公本發明相對現有北蟲草子實體的培養工藝優點在於可促進北蟲草的生理代謝機能，加快生長速度，縮短了北蟲草培養周期，可由目前的常規培養周期50天左右縮短到26天左右，產量可提高30%，可進一步滿足市場對北蟲草的需求。圖1為發明培養的北蟲草子實體照片。圖2為常規方法培育的北蟲草子實體照片。具體實施方式為了便於理解本發明，特例舉以下實施例。其作用被理解為是對本發明的闡釋而非對本發明的任何形式的限制。實施例1一、北蟲草的培養①馬鈴薯培養基(PDA培養基)配置②將北蟲草菌株接種於PDA斜面，26'C恆溫箱中培養7天，向斜面試管中注入無菌生理鹽水，振蕩後用無菌脫脂棉過濾，製成濃度約為3"(^個/mL的孢子懸液。③栽培培養基85份大米+15份蛹粉，含水量65%，分裝於玻璃瓶內，121°C35分鐘滅菌備用。④用滅過菌的槍頭將制好的孢子懸液加入米飯培養基，每罐頭瓶培養基加2mL孢子懸液(孢子濃度為3"(^個/mL)，後用滅過菌的竹筷將米飯攪拌均勻，用封口膜封好，轉入培養室培養。溫度控制在23"C左右，空氣相對溼度為60%左右，黑暗培養，菌絲封底後室內增加散射光，培養料表面或四周有桔黃色色素形成，即進入子實體管理時期。⑤菌絲轉色完成後，為刺激子實體原基形成，增加光照和溫差刺激，每天光照不少於10h，溫度19-25'C，相對溼度60-80%，每天通風10min以補充新鮮空氣，蛹蟲草子座長出後，增加光照強度，溫度保持20-23'C左右，空氣溼度60-85%左右，每天通風換氣3次，每次10min。二、添加植物生長素羥基磷灰石納米粒子一植物生長素製備及噴灑①溶液配置溶液A配製準確稱取無水乙酸f丐O.705g，加重蒸水定容至10ml，搖勻備用；溶液B配製準確稱取磷酸二氫銨1.381g，乙酸銨4.008g，加重蒸水45ml，用濃氨水調節pH值在7.6左右，補加重蒸水定容至50ml，搖勻備用；②羥基磷灰石納米粒子一植物生長素製備步驟l準確稱取赤黴素lrag，溶液B溶解，緩慢攪拌；步驟2將溶液A逐漸滴加到溶液B中，保持反應體系溫度在37±rC，pH值7.4±0.2之間，緩慢攪拌l小時；步驟3反應液4。C下10000rpm/min離心15分鐘；步驟4離心後沉澱室溫下乾燥48小時，4'C保存。③稱取羥基磷灰石納米粒子一植物生長素0.2g，用水定容1000ml，備用。④在培養瓶培養大約7天左右，即已從營養生長階段向生殖生長階段過渡時，將0.1%的植物生長素噴灑在菌表面。由於羥基磷灰石納米粒子一植物生長素具有緩慢釋放作用，因此在北蟲草生活周期中只需要噴灑一次。⑤培養至26天左右，子實體可長高到8-9cm左右，即可下架採摘。北蟲草子實體產量:每40g固體培養基得北蟲草子實體乾重5.16±0.4g。參見圖1權利要求1、一種可以縮短北蟲草子實體生長周期的培育方法，具體操作步驟包括1)北蟲草的培育①馬鈴薯培養基②將北蟲草菌株接種於PDA斜面，26℃恆溫箱中培養7天，向斜面試管中注入無菌生理鹽水，振蕩後用無菌脫脂棉過濾，製成濃度約為3*107個/mL的孢子懸液；③栽培培養基85份大米+15份蛹粉，含水量65％，分裝於玻璃瓶內，121℃35分鐘滅菌備用；④用滅過菌的槍頭將制好的孢子懸液加入米飯培養基，每罐頭瓶培養基加2mL孢子懸液，孢子濃度為3*107個/mL，後用滅過菌的竹筷將米飯攪拌均勻，用封口膜封好，轉入培養室培養；溫度控制在23℃左右，空氣相對溼度為60％左右，黑暗培養，菌絲封底後室內增加散射光，培養料表面或四周有桔黃色色素形成，即進入子實體管理時期；⑤菌絲轉色完成後，為刺激子實體原基形成，增加光照和溫差刺激，每天光照不少於10h，溫度19-25℃，相對溼度60-80％，每天通風10min以補充新鮮空氣，蛹蟲草子座長出後，增加光照強度，在500-700lx的散射光照，溫度保持23℃左右，空氣溼度65％左右，每天通風換氣3次，每次10min；2)噴灑植物生長素羥基磷灰石納米粒子-植物生長素製備及噴灑①溶液配置溶液A配製準確稱取無水乙酸鈣0.705g，加重蒸水定容至10ml，搖勻備用；溶液B配製準確稱取磷酸二氫銨1.381g，乙酸銨4.008g，加重蒸水45ml，用濃氨水調節pH值在7.6左右，補加重蒸水定容至50ml，搖勻備用；②羥基磷灰石納米粒子-植物生長素製備步驟1準確稱取赤黴素1mg，溶液B溶解，緩慢攪拌；步驟2將溶液A逐漸滴加到溶液B中，保持反應體系溫度在37±1℃，pH值7.4±0.2之間，緩慢攪拌1小時；步驟3反應液4℃下10000rpm/min離心15分鐘；步驟4離心後沉澱室溫下乾燥48小時，4℃保存；③稱取羥基磷灰石納米粒子-植物生長素0.2g，用水定容1000ml，備用；④在培養瓶培養大約7天左右，即已從營養生長階段向生殖生長階段過渡時，將0.1％的植物生長素噴灑在菌表面；⑤培養至26天左右，子實體可長高到8-9cm左右，即可下架採摘。全文摘要本發明提供一種可以縮短北蟲草子實體生長周期的培育方法，將北蟲草菌株接種於PDA斜面，恆溫箱中培養製成孢子懸液；用滅過菌的槍頭將制好的孢子懸液加入米飯培養基，轉入培養室培養；在營養生長階段向生殖生長階段過渡時，將羥基磷灰石納米粒子—赤黴素噴灑在菌表面，應用納米技術達到緩慢釋放赤黴素的目的，在整個北蟲草生長周期中，儀需噴灑一次；子實體生長已有2cm高左右時，將羥基磷灰石納米粒子—赤黴素噴灑在子實體表面噴灑一次；培養至26天左右，子實體可長高到8-9cm左右，即可下架採摘。本發明培育的北蟲草子實體生長周期縮短14天左右，產量可提高30％，可進一步滿足市場對北蟲草的需求。文檔編號C12N1/14GK101215528SQ200810050239公開日2008年7月9日申請日期2008年1月11日優先權日2008年1月11日發明者孟繁宇申請人:孟繁宇