豬細環病毒i型檢測的引物、探針及實時螢光pcr檢測方法

2023-06-06 07:25:06 2

豬細環病毒i型檢測的引物、探針及實時螢光pcr檢測方法
【專利摘要】本申請公開了一種用於豬細環病毒Ⅰ型檢測的引物、探針及其實時螢光PCR檢測方法。本申請為豬細環病毒I型的檢測提供了一種全新的檢測引物，具有很強的特異性和靈敏度，能夠滿足豬細環病毒I型的日常檢驗檢疫需求；為豬細環病毒I型的檢疫、流行病學調查，以及為生產中指導豬細環病毒I型的檢測提供了技術幫助。
【專利說明】豬細環病毒I型檢測的引物、探針及實時螢光PCR檢測方法
【技術領域】
[0001]本申請涉及分子檢測領域，特別是涉及一種用於豬細環病毒I型檢測的引物、探針及實時螢光PCR檢測方法。
【背景技術】
[0002]TTV是一種無包被的單股環狀負義的DNA病毒，由於最初是在肝炎患者中分離得到，猜測與肝炎有關，受到醫學領域的廣泛關注。豬源TTV的中文名字被定義為豬細環病毒(Torque Teno Sus Virus，TTSuV)。流行病學研究發現，TTV通過輸血、性行為、糞-口途徑等方式進行傳播，同時血液、唾液、糞便、乳汁、膽汁均可帶毒，通過不同人群的TTV的感染率的研究結果顯示:一般人群的感染率多在10%以上，呈無症狀攜帶。除了人可感染TTV以外，貓、狗、豬、牛、雞、羊、老鼠等動物也是TTV的宿主。Okamota H等根據人TTV非編碼區的DNA序列設計引物，擴增了豬、狗和貓血清中的TTV基因片段，發現在這幾個不同種屬中TTV基因序列和長度差異極大，核酸同源性較小，具有物種專一性。美國學者Leary等應用巢式PCR方法從豬血清中檢測到TTV (Sd-TTV31)，基因組長度為2878bp。2005年，Niel C等利用多重引導滾環式擴增法(Multiply primed rolling-circle amplification, RCA)檢測到豬TTV的另一種亞型:Sd-TTV2p，基因組長度為2735bp，與之前發現的Sd_TTV31的同源性非常低，只有45.1%，於是將TTSuV分為兩種基因型，TTSuVl型以Sd_TTV31為原型，TTSuV2型以Sd-TTV2p為原型。目前，統一的將TTSuVl型稱為豬細環病毒I型(簡寫TTSuVI)，TTSuV2型稱為豬細環病毒II型(簡寫TTSuV II)。 [0003]TTSuV和人TTV基因組結構組成相似，由非編區(UTR)和編碼區兩部分組成，非編區由一個富含GC的區域、一個啟動子和一個轉錄增強子組成，兩末端的GC區域形成具莖環的二級結構，在病毒複製中可能有重要調控作用；TTV編碼區包含3個開放閱讀框(0RF1~0RF3)、一個PolyA和一個TATA盒，變異率較高。ORFl的N端富含精氨酸(Arg)蛋白質，該蛋白質有可能是複製相關的蛋白-Rep蛋白；0RF2編碼與複製相關的蛋白；0RF3編碼結合蛋白，分為兩段，其中隔著一個類似於真核生物編碼區中內含子的序列。編碼區轉錄時產生3種不同的mRNA,能翻譯表達6種不同的蛋白。兩種基因型TTV編碼蛋白具有相似的序列和功能。
[0004]國外已有許多相關報導，表明TTSuV的感染在全球分布很廣且其流行率很高。Segales等對西班牙豬場1985-2005年採集的162份豬血清進行追溯性調查，結果在所有年份均檢出TTSuV病毒，TTSuVl和TTSuV2的感染率分別是33.3%(54/162)和55.6%(90/162)，兩種基因型共感染率為23.5% (38/162)，證實了 TTSuV的感染早在最初發現這病毒(Learyet al.，1999)的14年前就存在了。
[0005]近年來，國內也陸續開展了對TTSuV感染情況的研究。這些研究顯示，TTSuV在豬群中的感染在國內外已經非常普遍，是一個不容忽視的新病原。而目前對TTSuV的了解還非常有限，綜合國內外檢測TTSuV的方法主要有血清免疫學法和分子生物學法，血清免疫學法有酶聯免疫吸附(ELISA)法，ELISA是用於疫病檢測和監控的常用方法，但由於TTSuV具有高度基因變異性，不同基因亞型抗體間存在交叉反應，用它對基因變異進行分析時準確率較低，不能完全反映體內基因變異情況，更重要的是ELISA法的漏檢率較高。除此之外，由於感染時間較短而尚未產生抗體也可造成ELISA實驗結果的假陰性。
[0006]目前用於TTSuV檢測的分子生物學方法主要有普通PCR、套式PCR、半套式PCR和滾環擴等方法。常規PCR和套式PCR方法均根據目前已知的TTSuV基因序列的最保守的非編碼區來設計引物，對核酸進行檢測。滾環擴增法是以任意的寡核苷酸作為引物，在恆溫下以滾環擴增待測環狀DNA。由於血清中TTSuV病毒滴度較低，用普通PCR—輪難以擴增出目的片段，需加大循環數，但這樣會使引物非特異性結合或者聚合酶活性下降。巢氏PCR克服了單次擴增「平臺期效應」的限制且保證了反應的特異性，但是需要進行第二次PCRjI起交叉汙染的機率較大。普通PCR敏感性較差，巢氏PCR、半巢氏PCR和滾環擴增耗時較長，且這些傳統的PCR技術只能對基因的檢測做定性分析，無法精確的定量所檢測出的基因數量，大大制約了 PCR技術的應用。
[0007]Taqman螢光定量PCR是近年來發展起來的一項核酸檢測技術，可以快速、敏感地檢測出核酸中的目的基因。採用引物和探針相結合，對基因片段進行擴增，其特異性更強，檢測更準確。利用螢光信號與PCR產物的對應關係來對檢測樣本進行定性及定量分析，敏感性極高，可以檢測到幾個拷貝/μ L的病毒核酸。在檢測過程中螢光定量PCR方法無需進行凝膠電泳，用儀器收集螢光進行判斷結果，避免了人為主觀因素的影響。而且與常規PCR技術相比，其檢測速度更具有優勢，可以在4-6h內完成。而目前針對用於檢測TTSuV的高通量、快速、靈敏的Taqman螢光定量PCR檢測方法的研究較少；遠不能滿足檢驗檢疫實踐應用的需求。

【發明內容】

[0008]本申請的目的是提供一種全新的用於豬細環病毒I型檢測的引物、探針以及基於該引物和探針的實時螢光PCR檢測方法。
[0009]為了實現以上目的，本申請的一方面公開了一種用於豬細環病毒I型檢測的引物，該引物包括上遊引物和下遊引物，其中，上遊引物含有Seq ID N0.1所示序列，下遊引物含有Seq ID N0.2所不序列；
[0010]Seq ID N0.1:5，-GGTTCAGGAGGCTCAATTTGG-3』
[0011]Seq ID N0.2:5』 -TTTGAATTTAACGGTTTTCAGTCTTC-3』。
[0012]本申請的另一面公開了一種用於豬細環病毒I型檢測的探針，該探針含有Seq IDN0.3所示序列；
[0013]Seq ID N0.3:5，-TCGCTTCGCTCGCACCACGT-3，。
[0014]優選的，探針的5』端標記有突光報告基團,3』端標記有突光淬滅基團。
[0015]更優選的，探針的螢光報告基團為FAM，螢光淬滅基團為BHQ1。
[0016]本申請的另一面公開了一種豬細環病毒I型的實時螢光PCR檢測方法，包括採用本申請的引物和探針進行Taqman螢光定量PCR檢測。
[0017]本申請的再一面公開了一種豬細環病毒I型的檢測試劑盒，該檢測試劑盒中含有本申請設計的引物。
[0018]進一步的,本申請的檢測試劑盒中還含有本申請設計的探針。[0019]本申請的再一面公開了本申請的檢測試劑盒在豬細環病毒I型檢測中的應用。
[0020]本申請的再一面公開了一種採用本申請的檢測試劑盒對豬細環病毒I型進行的檢測，該檢測包括但不限於，常規PCR、染料法實時螢光PCR、探針法實時螢光PCR中的至少一種。
[0021]由於採用以上技術方案，本申請的有益效果在於:
[0022]本申請為豬細環病毒I型的檢測提供了一種全新的檢測引物，具有很強的特異性和靈敏度，能夠滿足豬細環病毒I型的日常檢驗檢疫需求；為豬細環病毒I型的檢疫、流行病學調查，以及為生產中指導豬細環病毒I型的檢測提供了技術幫助。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1:是本申請實施例中巢式PCR電泳結果圖，其中A為樣品擴增結果，B為克隆後的菌落PCR電泳結果；
[0024]圖2:是本申請實施例中提取質粒的酶切結果圖；
[0025]圖3:是本申請實施例中TTSuVl標準品(10-1）退火溫度優化結果；
[0026]圖4:是本申請實施例中TTSuVl標準品(10-1-10-6)退火溫度優化結果；
[0027]圖5:是本申請實施例中TTSuVl標準品(10-1-10-6)優化的標準曲線；
[0028]圖6:是本申請實施例中TTSuV2標準品(10-1)退火溫度優化結果；
[0029]圖7:是本申請實施例中TTSuV2標準品(10-1-10-6)退火溫度優化結果；
[0030]圖8:是本申請實施例中TTSuV2標準品(10-1-10-6)優化的標準曲線；
[0031]圖9:是本申請實施例中TTSuVl實時螢光PCR的特異性試驗結果；
[0032]圖10:是本申請實施例中TTSuV2實時螢光PCR的特異性試驗結果；
[0033]圖11:是本申請實施例中TTSuVl實時螢光PCR的靈敏度測試結果；
[0034]圖12:是本申請實施例中TTSuV2實時螢光PCR的靈敏度測試結果；
[0035]圖13:是本申請實施例中TTSuVI標準品的擴增曲線；
[0036]圖14:是本申請實施例中TTSuVl標準品的標準曲線；
[0037]圖15:是本申請實施例中TTSuV2標準品的擴增曲線；
[0038]圖16:是本申請實施例中TTSuV2標準品的標準曲線；
[0039]圖17:是本申請實施例中雙重實時螢光PCR的特異性結果；
[0040]圖18:是本申請實施例中雙重實時螢光PCR對TTSuVl的靈敏度檢測；
[0041]圖19:是本申請實施例中雙重實時螢光PCR對TTSuV2的靈敏度檢測。
【具體實施方式】
[0042]本申請以TTSuV不同基因型的保守序列為目的片段進行研究，設計實時螢光定量PCR的引物及Taqman探針，最終獲得分別針對TTSuVl和TTSuV2的非編碼區(UTR)設計的特異性引物和Taqman探針，分別建立檢測TTSuVl和TTSuV2的單重實時螢光PCR檢測方法。另外，考慮到臨床檢測的工作量和檢驗檢疫業務快速準確的要求，本申請在建立的單重實時螢光PCR方法的基礎上，建立了同時檢測TTSuVl和TTSuV2雙重實時螢光PCR方法。
[0043]本申請在現有研究的基礎上進一步研究，從而獲得了一對全新的檢測引物和探針，為豬細環病毒I型和豬細環病毒II型的檢測提供了一種新的方案，從而提高了檢驗檢疫的質量和工作效率，對檢驗檢疫和實踐生產都具有重要的意義。需要說明的是，本申請的引物和探針都是針對實時螢光PCR檢測而設計的，具體的是特別針對雙重實時螢光PCR方法而設計的；因此，本申請的引物和探針都具有很好的特異性；可以理解，在本申請的基礎上，完全可以單獨將本申請的引物直接用於常規PCR檢測或者其它基於PCR擴增的檢測；同樣的，本申請的探針也完全可以用於除了本申請的實時螢光PCR方法的其它檢測中，比如基因晶片檢測，或者其它基於核苷酸片段的檢測。其中，基於PCR擴增的檢測如基因晶片的靶標片段擴增、克隆、測序等。
[0044]還需要說明的是，將本申請的探針用於實時螢光PCR檢測時，根據探針法實時螢光PCR檢測的原理，探針的5』端需要標記螢光報告基團，3』端需要標記螢光淬滅基團，可以理解，如果不考慮雙重或多重實時螢光PCR檢測，現有的螢光報告基團和螢光淬滅基團都可以用於本申請。另外，本申請的實時螢光PCR檢測方法中，其關鍵在於採用了本申請設計的引物和探針，可以理解，檢測樣品可以是培養提純的病毒樣品、提取自疑似感染的生物的組織或分泌物的樣品或通過其它方式提取或保存的樣品。
[0045]在本申請的引物、探針和實時螢光PCR檢測方法的基礎上，本申請進一步研究了用於檢測豬細環病毒I型的檢測試劑盒。可以理解，直接將本申請的引物或探針製備成乾粉或者高濃度的溶液即可作為試劑盒組分保存備用。另外，如前面所提到的，本申請的引物或者探針可以單獨的用於其它的檢測使用，因此，試劑盒中同樣可以只含有引物或探針；此外，對於涉及到的常規PCR檢測或實時螢光PCR檢測等所需要的試劑，可以直接放置於本申請的試劑盒中，也可以在使用試劑盒時，從市場購買相應的試劑，在本申請中不做具體限定。 [0046]本申請中的檢測試劑盒在豬細環病毒I型檢測中的應用，如前面所述，同樣的，該應用也包括了目前的各種基於引物和/或探針的核酸分子檢測；如常規PCR、實時螢光PCR、基因晶片、克隆、測序等等。
[0047]還需要說明的是，本申請中的染料法實時螢光PCR和探針法實時螢光PCR是實時螢光PCR方法中的兩大類型；染料法實時螢光PCR如SYBR GREEN等，是利用染料與雙鏈DNA結合後螢光強度大大增強實現檢測的，因此可以僅用一對特異性的引物即可進行；探針法實時螢光PCR如Taqman實時螢光PCR，是利用特異性探針兩端標記的螢光報告基團和螢光淬滅基團，在探針完整時報告基團的信號被淬滅基團吸收，而PCR擴增時將結合到模板上的特異性探針被酶切降解，報告基團和淬滅基團分開，產生可以被檢測的螢光信號，實現實時螢光PCR檢測。
[0048]下面通過具體實施例並結合附圖對本申請作進一步詳細說明。以下實施例僅僅對本申請進行進一步的說明，不應理解為對本申請的限制。
[0049]一、試驗材料和設備
[0050]1.工具酶和主要試劑
[0051]MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit 購自 Roche。Premix ExTaqTM(Perfect Real Time) >Premix Ex Taq、Ex Taq、dNTP Mixture、2XGC buffer 1、DNAMarker DL2000、DNA Marker DL5000、凝膠 DNA 回收試劑盒、pMD18_T Vector、質粒 DNA 小量純化試劑盒等購於大連寶生物公司。Jml09大腸桿菌、IPTG、X-Gal、甘油、NaCl均為分析純，購自上海生工。Ampicillin、CaC12購自Sigma。瓊脂糖購自Promega。胰蛋白腖、酵母提取物、瓊脂粉等購自廣東環凱微生物科技公司。膠紅購自Biotium。
[0052]2.試驗儀器
[0053]本實驗中使用的主要儀器如表1所示。
[0054]表1實驗中使用的主要儀器
[0055]
【權利要求】
1.一種用於豬細環病毒I型檢測的引物，其特徵在於:所述引物包括上遊引物和下遊引物，所述上遊引物含有Seq ID N0.1所示序列，所述下遊引物含有Seq ID N0.2所示序列；
Seq ID N0.1:5』 -GGTTCAGGAGGCTCAATTTGG-3』
Seq ID N0.2:5』 -TTTGAATTTAACGGTTTTCAGTCTTC-3』。
2.一種用於豬細環病毒I型檢測的探針，其特徵在於:所述探針含有Seq ID N0.3所示序列；
Seq ID N0.3:5，-TCGCTTCGCTCGCACCACGT-3，。
3.根據權利要求2所述的探針，其特徵在於:所述探針的5』端標記有螢光報告基團，3』端標記有螢光淬滅基團。
4.根據權利要求3所述的探針，其特徵在於:所述螢光報告基團為FAM，所述螢光淬滅基團為BHQl。
5.一種豬細環病毒I型的實時螢光PCR檢測方法，包括採用權利要求1所述的引物和權利要求3或4所述的探針進行Taqman螢光定量PCR檢測。
6.一種豬細環病毒I型的檢測試劑盒，其特徵在於:所述檢測試劑盒中含有權利要求1所述的引物。
7.根據權利要求6所述的檢測試劑盒，其特徵在於:所述檢測試劑盒中還含有權利要求2-4任一項所述的探針。
8.根據權利要求6或7所述的檢測試劑盒在豬細環病毒I型檢測中的應用。`
9.一種採用權利要求6或7所述的檢測試劑盒對豬細環病毒I型進行的檢測，所述檢測包括但不限於，常規PCR、染料法實時螢光PCR、探針法實時螢光PCR中的至少一種。
【文檔編號】C12R1/93GK103882151SQ201410105925
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月20日 優先權日:2014年3月20日
【發明者】楊春華, 孫思揚, 陳慶富, 佔春瑞 申請人:江西出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術中心