尿中1‑溴丙烷頂空氣相色譜測定方法與流程
2023-06-06 16:32:11
本發明屬於尿中1-溴丙烷的檢測方法，具體涉及尿中1-溴丙烷頂空氣相色譜測定方法。
背景技術：
：1-溴丙烷為無色液體，有刺激性氣味；分子量為122.99；蒸汽壓為16.39kpa/25℃；閃點為26℃；熔點為-110℃；沸點為70.9℃；不溶於水，溶於醇、醚、四氯化碳；相對密度(水=1)為1.36；相對密度(空氣=1)為4.3；化學性質穩定；主要用作溶劑，常用於生產噴霧黏合劑、精密儀器的清洗劑和脫脂劑，也作為製藥產業、殺蟲劑和季胺類化合物合成的中間體。1-溴丙烷生產時的主要原料為正丙醇，其主要副產物為2-溴丙烷，因此職業接觸人群的尿中有可能含有正丙醇和2-溴丙烷,與2-溴丙烷相比,1-溴丙烷對精原細胞的毒性較小，但神經毒性和抑制精子成熟的毒性較強,且能損害人的中樞神經系統。近年來我國電子、農藥、染料、醫藥、造紙、製革等產業發展迅速，每年溴代烷烴的需求量超過14000t，其中高純度的i-bp為8000t。接觸工人數量大，從國外人群流行病學資料研究表明其短期大劑量接觸和長期接觸均可以對人體造成職業性損害，故其潛在隱患不容忽視。為切實做好i-bp中毒的三級預防，做到防患於未然，目前亟須在1-bp中毒機制、生物接觸限值及檢測、中毒診斷標準等諸多方面進行深入研究，儘快制定尿中1-bp檢測標準。1-bp的代謝過程較為複雜,jonesar等人進行1-bp毒代動力學動物實驗時，發現大部分1-bp可不經過轉變以原型隨呼吸或尿液排出，染毒後100h25%的1-bp經尿液排出，部分代謝為n-乙醯基-s-(正丙基)-l-半胱氨酸（acprcys）及其相應的氧化產物。另外，kawai等人在日本1-bp職業暴露人群中開展的研究，分析顯示職業暴露工人班後尿樣中1-bp濃度同外暴露量呈高度線性相關，同時未暴露1-bp的對照組工人，尿樣中均未檢出1-bp的存在，提示班後尿中1-bp可以很好地用於監測1-bp暴露。目前，見諸報導的測定尿中1-bp的檢測方法均為頂空-氣相色譜法，區別在於所選用的頂空裝置和檢測器不同。技術實現要素：本發明的目的在於提供一種尿中1-溴丙烷頂空氣相色譜測定方法，使用毛細管色譜柱，響應值大，1-bp和溶劑峰及尿樣中其他雜質峰實現了較好分離，檢測時間短，靈敏度高。為了實現上述目的，本發明採用的技術方案為：一種尿中1-溴丙烷頂空氣相色譜測定方法，包括如下步驟：1）樣品溶液的配置：在頂空瓶中加入尿樣和無水硫酸鈉密封；2）標樣溶液的配置：在頂空瓶中加入不同濃度的1-溴丙烷溶液和無水硫酸鈉密封；3）繪製標準曲線：採用頂空氣相色譜對多組標樣溶液進行分析，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪製標準曲線；4）對樣品溶液進行檢測：採用頂空氣相色譜對樣品溶液進行分析，得到峰面積，將峰面積帶入標樣曲線的回歸方程中，得到尿中1-溴丙烷的濃度。步驟2）中1-溴丙烷溶液濃度從0μg/l開始，以20~100μg/l遞增至1000μg/l。步驟3）和4）所述頂空氣相色譜中頂空進樣器的平衡溫度為80~100℃，平衡時間為5~15min。步驟3）和4）所述頂空氣相色譜中色譜條件為：進樣口溫度200℃,柱溫55℃，保持2min，再以15℃/min升至130℃，保持1min;以6∶1的分流比進樣;載氣高純氦氣;柱流量1ml/min。電離方式ei，離子源溫度230℃;輔助接口溫度280℃;電子轟擊電壓70ev;掃描方式單離子檢測掃描。無水硫酸鈉的用量為0.05~0.5g/每毫升尿樣。頂空瓶中加無水硫酸鈉可提高1-bp在頂空相中濃度以提高實驗靈敏度。色譜柱選擇毛細管色譜柱，所述檢測器為氫火焰離子檢測器。色譜柱為peg-20m石英毛細管柱或者hp-5ms石英毛細柱。色譜柱為peg-20m石英毛細管柱時優選平衡溫度為100℃，平衡時間為8min。色譜柱為hp-5ms石英毛細柱時優選平衡溫度為90℃，平衡時間為10min。本發明選用色譜柱hp-5ms，與hp-5相比，hp-5色譜柱固定相為：（5%）-二苯基（95%）-二甲基聚矽氧烷；而hp-5ms柱的固定相為：（5%）-二苯基（95%）-二甲基亞芳基矽氧烷共聚物，兩者相差了「亞芳基」，因此hp-5ms具有更好的熱穩定性，流失降低，基線低，響應好。有益效果：本發明使用peg-20m石英毛細管柱或者hp-5ms石英毛細管色譜柱，熱穩定性好，1-bp響應值大，且1-bp和溶劑峰及尿樣中其他雜質峰實現了較好分離，出峰時間短，靈敏度高，檢測時間短。應用本方法經河南省職業病防治院、深圳市職業病防治院、揚州市疾病預防控制中心三家單位的方法驗證，檢出限低至2.0μg/l，相對標準偏差為1.0-8.5，精密度高，批內精密度為2.4％～5.7％，批間精密度為4.8％～6.6％。本法使用的儀器和試劑，在國內職業衛生監測實驗室較普及。附圖說明圖1頂空溫度選擇實驗結果；圖2頂空平衡時間選擇實驗結果；圖3尿中1-bp測定的工作曲線圖；圖41-bp測定幹擾試驗色譜圖；圖5尿中1-bp穩定性實驗結果。具體實施方式以下實施例中，頂空氣相色譜中色譜條件為：進樣口溫度200℃,柱溫55℃，保持2min，再以15℃/min升至130℃，保持1min;以6∶1的分流比進樣;載氣高純氦氣;柱流量1ml/min。電離方式ei，離子源溫度230℃;輔助接口溫度280℃;電子轟擊電壓70ev;掃描方式單離子檢測掃描。頂空瓶中尿樣與無水硫酸鈉的用量關係為每毫升尿樣加入0.5g無水硫酸鈉。實施例1本實施例說明色譜柱的選擇分別試驗了hp-5、hp-1、hp-ffap、peg-20m、hp-5ms柱等不同毛細管色譜柱及色譜條件測定尿中1-bp，結果表明，使用hp-ffap、peg-20m、hp-5ms毛細管色譜柱，1-bp和溶劑峰及尿樣中其他雜質峰實現了較好分離，其中peg-20m、hp-5ms的分離時間更短，出峰穩定，峰形好，靈敏度更高。頂空溫度選擇：分別在60℃、70℃、80℃、90℃、100℃條件下，對尿樣（100μg/l）進行測定，均恆溫10min，結果表明，採用peg-20m石英毛細管柱，在100℃時1-bp響應到達最大值，110℃時開始顯著下降，故選擇100℃作為頂空溫度，在頂空溫度為100℃，振搖速率為250rpm的條件下，對尿樣（100μg/l）進行測定，在平衡時間為4、8、10、20min分別進樣，8min後峰面積不再增加，故選擇平衡時間為8min。採用hp-5ms石英毛細柱，在90℃時1-bp響應到達最大值，故選擇90℃作為頂空溫度，見圖1。在頂空溫度為90℃，振搖速率為250rpm的條件下，對尿樣（100μg/l）進行測定，在平衡時間為5、10、15、20min分別進樣，10min後峰面積不再增加，故選擇平衡時間為10min，見圖2。尿樣成分複雜，水佔96%-97%，其他為尿素，尿酸，肌酐，氨等非蛋白氮化合物、硫酸鹽等成分，1-溴丙烷含量低微，由於填充柱柱效低，採用填充柱很難使各組分完全分離，且峰形寬，只能檢出少量組分，結果不理想。因此我們選用石英毛細管色譜柱。1-溴丙烷與2-溴丙烷分子量相近，只在結構上稍有差異，採用弱極性和中等極性的色譜柱不能使它們完全分離，而選用強極性的peg-20m毛細管色譜柱，並用程序升溫技術，能有效地把各組分分離，達到了較為理想的效果，以下實施例中均採用peg-20m毛細管色譜柱測定。實施例2本實施例說明檢出範圍及檢出限採用1-bp(德國dr.ehrenstorfer公司，純度98%)配置濃度為0、20、40、60、100、200、500、1000μg/l的標準系列，以濃度為橫坐標，峰面積平均值為縱坐標繪製標準曲線，線性方程為y=34.0x-14.6（r=0.9992）（見圖3所示）；檢出限確定採用噪聲法，3倍噪聲對應的檢出限濃度為2μg/l，定量下限為10μg/l。配製10μg/l尿樣做準確度、精密度實驗，回收率為98.6%，相對標準偏差為6.1%，見圖3。實施例3本實施了說明檢測準確度及精密度製備工作曲線範圍內低中高三種濃度100、200、500μg/l的加標尿樣（內標1-bb），每種濃度6份，當天測定，連續測定3d，計算平均回收率和精密度。結果，高、中、低濃度樣品的加標回收率為96.8％～104.8％，批內精密度為2.4％～5.7％，批間精密度為4.8％～6.6％，見表1。均符合《生物材料分析方法的研製準則》的要求。表1 方法的平均回收率與相對標準偏差（n=6），%加標100μg/l加標200μg/l加標500μg/lrecovery104.896.8100.9rsd（批內）4.62.45.7rsd（批間）6.64.86.4幹擾試驗：在加標尿樣（100μg/l）中分別加入微量正丙醇(主要生產原料)和2-溴丙烷（主要副產物），按照樣品測定過程進行檢測，結果表明上述化合物不幹擾尿中1-溴丙烷的測定，且分離效果好，見圖4。樣品穩定性試驗：配製濃度為1000μg/l尿樣36份，分為6組，每組6份，分別在0h、8h、24h、3d、7d、14d測定，結果表明，現場採集尿樣、壓緊頂空瓶蓋後至少可以保存7d，見圖5。本發明提供的方法，經河南省職業病防治院、深圳市職業病防治院、揚州市疾病預防控制中心三家單位的方法驗證。驗證結果見表2。表2三家單位驗證結果當前第1頁12