可溶性Fas分子應用於腫瘤耐藥性檢測及化療療效預測的製作方法

2023-06-18 12:44:31 2

專利名稱：可溶性Fas分子應用於腫瘤耐藥性檢測及化療療效預測的製作方法
技術領域：
本發明涉及可溶性Fas作為腫瘤耐藥性評價的血清學標誌，應用於腫瘤細胞耐藥性的臨床評價及化療療效判斷。
腫瘤細胞的耐藥性是臨床腫瘤化療緩解率底復發率高的主要原因，目前尚無理想的耐藥逆轉藥物應用於臨床，在這種情況下，及時、準確評價腫瘤耐藥性對指導臨床合理用藥和及時調整治療方案具有重要的意義，現今運用於臨床的耐藥評價方法主要有體外藥物敏感實驗和RT-PCR、免疫組化評價mdrl基因等。目前國內外尚未找到可反映腫瘤耐藥性的血清學標誌，致使尚未有耐藥性的血清學評價方法運用於臨床。
本發明是提供一個用於腫瘤細胞耐藥性評價及對化療療效進行判斷的血清學標誌目前所知，Fas(CD95)為分子量48KD的跨膜蛋白，在許多正常組織及部分腫瘤組織中表達。人Fas基因共由九個外顯子組成[26]，mRNA剪接形式的差異可產生跨膜區及部分胞內區缺失的可溶型分子(Souble Fas，sFas)。sFas可以阻斷Fas介導的凋亡。近年研究表明Fas介導的凋亡是化療藥物殺傷腫瘤細胞的重要機制，我們尚未公開的研究結果顯示耐藥腫瘤細胞系表達sFas，其培養液上清中sFas濃度高於親本細胞；完全緩解(CR)和部分緩解(PR)的腫瘤病人血清sFas濃度顯著低於未緩解(NC)和進展(PD)的病人，這些研究結果尚未見國內外類似文獻報導，提示sFas表達水平高低和腫瘤的耐藥有關，腫瘤病人血清sFas的濃度水平可反映病人的化療療效。由此推斷，血清sFas水平可能作為腫瘤耐藥性的一種血清學指標用於評價腫瘤的耐藥並判斷化療療效。
雙抗體夾心ELISA法測定的腫瘤病人血清sFas，在濃度小於20ng/ml時，反映腫瘤細胞對化療藥物敏感，在大於30ng/m1時基本反映腫瘤細胞對化療藥物抵抗。
本發明的來源1.Fas mRNA在轉錄後水平上剪接形式差異造成跨膜區及部分胞內區缺失，導致部分N末端結構即sFas釋放至細胞外液中，腫瘤病人血清sFas可採用雙抗體夾心ELISA法評價。
2.我們尚未公開的研究結果顯示耐藥腫瘤細胞系其培養液上清中sFas濃度高於親本細胞；完全緩解(CR)和部分緩解(PR)的腫瘤病人血清sFas濃度顯著低於未緩解(NC)和進展(PD)的病人。以下所述的實例詳細說明了本發明實施例1實驗材料1.細胞系及培養條件。
耐藥乳腺癌細胞系MCF-7/Adr，系阿黴素低劑量逐級誘導產生的耐藥亞系。MCF-7/Adr和其親本系MCF-7均於DMEM完全培養基中生長，由本室傳代培養。2.主要試劑和器材Tnzol、Tag酶、Fas引物、cDNA合成試劑盒，抗sFas單抗、生物素標記抗sFas單抗，HRP-avidin、sFas標準品、24孔細胞培養板、酶標板。3.主要設備FS-919 PCR儀、TGL-16高速臺式離心機、DG3022A酶聯免疫評儀。實驗方法1.RT-PCR檢測sFas mRNA表達Trizol試劑提取MCF-7/Adr和MCF-7細胞總RNA，分別取1μg總RNA進行逆轉錄PCR檢測Fas mRNA轉錄體表達形式結果顯示耐藥細胞MCF-7/Adr表達高水平sFas mRNA而親代敏感細胞MCF-7表達高水平Fas mRNA，sFas mRNA表達水平極低。
2.雙抗體夾心ELISA法評價培養液上清sFas濃度2×105/孔MCF-7、MCF-7/Adr接種於24孔板，每孔加入1ml培養基，24小時後，吸取100μl培養液上清。將不同稀釋度的標準品或培養液上清100μl加入抗sFas單抗預包被酶標孔，混勻，封孔，37℃ 60分鐘，洗板，加入生物素標記抗sFas單抗，37℃ 60分鐘，洗板，依次加入酶聯物和底物，450nm讀取OD值，根據標本OD值可在標準曲線上查出對應濃度。結果MCF-7/Adr sFas濃度為76.4±8.4ng/ml(n＝4)，MCF-7 sFas濃度為9.8±2.1ng/ml(n＝4)，表明耐藥系MCF-7/Adr sFas表達明顯高於其親本系。實施例2實驗材料1.病例選擇乳腺癌病人20例，中位年齡43歲(33-54歲)2.主要試劑抗sFas單抗、生物素標記抗sFas單抗，HRP-avidin、sFas標準品、24孔細胞培養板、酶標板。
3.主要器材DG3022A酶聯免疫評價儀實驗方法1.化療方案和療效判斷化療方案Taxol+CDDP療效判斷按照WHO制定的評價標準進行療效判斷，20例病人中完全緩解(CR)4例、部分緩解(PR)9例、未緩解(NC)+進展(PD)7例。
2.血清sFas濃度評價分離病人血清，如實施例1所述方法測定sFas濃度。分析不同化療療效病人sFas濃度的差異，結果如表1(下頁)，NC+PD病人血清sFas濃度顯著高於CR和PR病人(P＜0.01)，而CR和PR病人之間血清sFas濃度無明顯差異，表明化療療效差的乳腺癌病人血清sFas的濃度水平顯著高於療效較好的乳腺癌病人。提示血清sFas的濃度水平可反映乳腺癌的化療療效，由此推測血清sFas水平可作為一種評價乳腺癌耐藥性的血清學指標，判斷乳腺癌的化療療效。
表一.不同療效乳腺癌病人血清sFas濃度療效例數 濃度(ng/ml)CR 4 14.3±2.43PR 9 17.7±2.21NC+PD 7 34.7±5.84****P＜0.01，和CR、PR比較實施例3實驗方法1.化療方案和療效判斷化療方案IFO+DDP+VDS療效判斷按照WHO制定的評價標準進行療效判斷，18例病人中完全緩解(CR)1例、部分緩解(PR)6例、未緩解(NC)+進展(PD)11例。
2.血清sFas濃度評價如實施例2所述方法。結果如表2，NC+PD肺腺癌病人血清sFas濃度顯著高於CR和PR病人(P＜0.01)，而CR和PR病人之間血清sFas濃度無明顯差異表明化療療效差的肺腺癌病人血清sFas的濃度水平顯著高於療效較好的肺腺癌病人。提示血清sFas的濃度水平可反映肺腺癌的化療療效，由此推測血清sFas水平可能作為一種評價肺腺癌耐藥性的血清學指標，判斷肺腺癌的化療療效。
表2不同療效肺腺癌病人血清sFas濃度療效判斷例數濃度(ng/ml)CR 1 10.7PR 6 13.2±1.02NC+PD 11 38.6±0.92****P＜0.01，和CR、PR比較
權利要求
1.可溶性Fas應用於腫瘤耐藥性評價，其特徵在於(1)Fas mRNA轉錄後剪接形式差異造成跨膜區及部分胞內區缺失，導致部分N末端結構即可溶性Fas釋放至血清中，採用雙抗體夾心ELISA法可評價腫瘤細胞培養液上清或腫瘤病人血清可溶性Fas的濃度。(2)我們尚未公開的研究結果顯示血清可溶性Fas可作為腫瘤耐藥性的血清學標誌。
2.按照權利要求1所述用於腫瘤耐藥性評價的腫瘤病人血清可溶性Fas，其特徵在於濃度小於20ng/ml時，可反映腫瘤細胞對化療藥物敏感。
3.按照權利要求1所述用於腫瘤耐藥性評價的腫瘤病人血清可溶性Fas，其特徵在於濃度大於30ng/ml時可反映腫瘤細胞對化療藥物抵抗。
4.按照權利要求1至3所述，血清可溶性Fas作為腫瘤耐藥性的血清學標誌，運用於腫瘤細胞耐藥性的評價及化療療效判斷。
全文摘要
本發明公開了腫瘤耐藥的一種血清學標誌－sFas。運用雙抗體夾心ELISA法評價sFas發現耐藥腫瘤細胞培養液上清中sFas濃度高於親本細胞;完全緩解和部分緩解的腫瘤病人血清sFas濃度顯著低於未緩解和進展的病人,提示血清sFas水平可能作為一種反映耐藥發生和程度的血清學指標,並可反映化療療效。因此血清sFas可用於腫瘤細胞耐藥性的臨床評價及判斷腫瘤的化療療效。
文檔編號G01N33/53GK1250163SQ99116289
公開日2000年4月12日 申請日期1999年7月19日 優先權日1999年7月19日
發明者張積仁, 陳俊 申請人:第一軍醫大學珠江醫院