一株降解除草劑普施特的細菌及其用途的製作方法與工藝

2023-06-18 23:11:11 1

本發明涉及微生物領域中一株降解除草劑普施特的細菌及其用途。

背景技術：
普施特，又名咪草煙，英文名稱Pursuit(imazethapyr-ammonium)，化學名稱(RS)-5-乙基-2-(4-異丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)煙酸。化學結構如式1所示：普施特是咪唑啉酮類除草劑，是側鏈胺基酸合成抑制劑，芽前或芽後均可施用，對大豆和其他豆科植物農田的禾本科雜草和某些闊葉雜草如莧菜、蓼、藜、龍葵、蒼耳、稗草、狗尾草、馬唐、黍等有優異的防治效果。普施特為長殘效除草劑，優點是除草效果好、殺草譜寬、用藥量少、使用方便、用藥成本低，但它們在土壤中殘留時間長，一般可達2－3年，在連作或輪作農田中使用極易造成後茬作物藥害、減產、甚至絕產，並嚴重影響了農業種植業結構的調整。長殘效除草劑使後茬作物受藥害減產、絕產事件時有發生。主要表現為：一是在黑龍江、吉林、內蒙古一些地方把大豆田改為水田，種植水稻受害嚴重，甚至絕產。二是除草劑施後3－4年仍有藥害，導致甜菜種植業下滑。三是經濟作物發展受影響，白瓜籽、向日葵、馬鈴薯、亞麻和蔬菜等受到傷害，嚴重者基地受毀。內蒙古東北部幾年前就想調整種植業結構，因小麥、大豆田多年使用長殘效除草劑使種植馬鈴薯、亞麻、白瓜子、芸豆等經濟作物未能實現，嚴重製約了本地經濟發展。四是玉米、高粱、穀子等作物受害，矮化減產或絕產。自然界除草劑殘留的降解主要依靠土壤中微生物來完成，但自然降解十分緩慢。因此，有針對性地篩選高效微生物菌株，研製微生物修復劑，通過人工接種加速土壤長殘效除草劑的降解、消除農田除草劑殘留藥害是一項十分必要的工作和切實可行的途徑。

技術實現要素：
本發明所要解決的技術問題是如何降解除草劑普施特。為解決上述技術問題，本發明提供了一株可以降解除草劑普施特的細菌。本發明提供的細菌是中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31，該菌株已於2014年10月28日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號)，保藏編號為CGMCCNo.9865。本發明的另一個目的是提供一種菌劑，該菌劑的活性成分為所述的中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865。上述菌劑可為下述1)或2)所述菌劑：1)用於降解除草劑普施特的菌劑；2)用於修復土壤除草劑普施特汙染的菌劑。所述菌劑還可以包括載體。所述載體可為固體載體或液體載體。所述固體載體可為礦物材料、植物材料或高分子化合物；所述礦物材料可為粘土、滑石、高嶺土、蒙脫石、白碳、沸石、矽石和硅藻土中的至少一種；所述植物材料可為玉米粉、豆粉和澱粉中的至少一種；所述高分子化合物可為聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液體載體可為有機溶劑、植物油、礦物油或水；所述有機溶劑可為癸烷和/或十二烷。所述菌劑中，所述活性成分可以以被培養的活細胞、活細胞的發酵液、細胞培養物的濾液或細胞與濾液的混合物的形式存在。所述組合物的劑型可為多種劑型，如液劑、乳劑、懸浮劑、粉劑、顆粒劑、可溼性粉劑或水分散粒劑。根據需要，所述菌劑中還可添加表面活性劑(如吐溫20、吐溫80等)、粘合劑、穩定劑(如抗氧化劑)、pH調節劑等。所述的中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865或以中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865為活性成分的菌劑在降解除草劑普施特中的應用也屬於本發明的保護範圍。所述的中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865或以中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865為活性成分的菌劑在修復土壤除草劑普施特汙染中的應用也屬於本發明的保護範圍。本發明的再一個目的是提供一種培養中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865的方法。本發明所提供的培養中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865的方法包括將中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865在用於培養中間根瘤菌的培養基中培養的步驟。本發明的又一個目的是提供一種以中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865為活性成分的菌劑的製備方法。本發明所提供上述菌劑的製備方法，包括如下步驟：將所述的中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865作為活性成分，得到所述菌劑。本發明是從長期受到除草劑普施特汙染的農田採集土樣，並從中分離篩選得到的除草劑普施特降解菌中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865。實驗證明，該菌株在無機鹽培養基中7天對100mg/L普施特的降解率達到84.62％。這表明該菌株能降解除草劑普施特，在修復土壤除草劑普施特汙染方面具有廣闊的應用前景。保藏說明菌種名稱：中間根瘤菌拉丁名：(Mesorhizobiumsp.)菌株編號：198-R-31保藏機構：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機構簡稱：CGMCC地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號保藏日期：2014年10月28日保藏中心登記入冊編號：CGMCCNo.9865具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中所用的培養基如下：無氮液體培養基：溶質及其濃度為蔗糖10g/L，NaCl0.12g/L，K2HPO4·3H2O0.5g/L，CaCO31g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L；溶劑為蒸餾水；pH7.2。無氮固體培養基：向無氮液體培養基中加瓊脂至其含量為15-20g/L得到的培養基。牛肉膏蛋白腖液體培養基：溶質及其濃度為牛肉膏5g/L、蛋白腖10g/L、NaCl5g/L；溶劑為蒸餾水；pH7.2。牛肉膏蛋白腖固體培養基：溶質及其濃度為牛肉膏5g/L、蛋白腖10g/L、NaCl5g/L、瓊脂15-20g/L；溶劑為蒸餾水；pH7.2。無機鹽液體培養基：溶質及其濃度為NH4Cl1.0g/L，KH2PO40.5g/L，K2HPO41.5g/L，MgSO40.2g/L，NaCl0.5g/L；溶劑為蒸餾水；pH7.2。無機鹽固體培養基：向無機鹽液體培養基中加瓊脂至其含量為2％得到的培養基。實施例1、中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865的分離與鑑定一、普施特降解菌198-R-31的分離1、在100ml無菌水中加入10g土壤樣品(採自中國黑龍江黑河受除草劑汙染的農田)振蕩培養30min製成混濁液。吸取1ml上述混濁液加入盛有9ml無菌水中的試管中充分混勻(此時稀釋度記為10-1)，然後從此試管中吸取1ml加入到另一盛有9ml無菌水的試管中混合均勻，以此類推製成10-2、10-3、10-4、10-5不同稀釋度的菌懸液。將各稀釋度取0.1ml均勻塗布在無氮固體培養基平板上，28℃恆溫靜置培養2—3天。待菌落形成後，在無氮固體培養基平板上進行菌種純化。2、對除草劑普施特、乙草胺、氯嘧磺隆和雜草焚降解能力的初步篩選採用平板透明圈法。將普施特標準品(Fluka公司產品)加入無機鹽固體培養基使其含量為1000mg/L，得到普施特平板；將乙草胺標準品(Fluka公司產品)加入無機鹽固體培養基使其含量為1000mg/L，得到乙草胺平板；將氯嘧磺隆標準品(Fluka公司產品)加入無機鹽固體培養基使其含量為1000mg/L，得到氯嘧磺隆平板；將雜草焚標準品(Fluka公司產品)加入無機鹽固體培養基使其含量為1000mg/L，得到雜草焚平板。將普施特平板、乙草胺平板、氯嘧磺隆平板和雜草焚平板進行分區，吸取步驟1純化得到的每株菌的菌懸液10μL(各種菌株菌懸液的菌體含量相同)分別點種到四種平板上(每株菌在一個平板上重複3次)，28℃培養、觀察。篩選到一株在普施特平板上能形成較大透明圈的菌株，將其命名為普施特降解菌198-R-31。普施特降解菌198-R-31在乙草胺平板、氯嘧磺隆平板和雜草焚平板上均不能形成透明圈。說明普施特降解菌198-R-31能降解普施特，不能降解乙草胺、氯嘧磺隆和雜草焚。表1.普施特降解菌198-R-31對四種除草劑降解能力初篩結果菌株編號普施特乙草胺氯嘧磺隆雜草焚普施特降解菌198-R-31+－－－註：「+」表示形成較大透明圈，「－」表示無透明圈形成。二、普施特降解菌198-R-31的鑑定從以下幾個方面鑑定步驟一分離並純化得到的普施特降解菌198-R-31：1、形態學鑑定將處於對數生長期且菌落大小穩定，上述步驟一分離並純化得到的普施特降解菌198-R-31進行單菌落狀態觀察，主要包括菌落的大小、顏色、透明度、溼潤度、菌落表面狀態(是否平坦、突起、褶皺、凹陷等)、菌落邊緣狀態(是否整齊、不規則、放射狀等)。結果表明，上述步驟一分離並純化得到的普施特降解菌198-R-31菌落凸起、乳白色、粘稠、邊緣規則；菌落小，直徑0.4-0.9mm。2、生理生化特徵分析參考《常見細菌系統鑑定手冊》(東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統鑑定手冊.北京:科學出版社，2011.)和《微生物學實驗》(沈萍,範秀容,李廣武.微生物學實驗(第三版).北京:高等教育出版社,1999.)測定上述普施特降解菌198-R-31的生理生化特徵。所述普施特降解菌198-R-31的生理生化特徵測定結果如表2所示：表2.普施特降解菌198-R-31的生理生化特徵註：「+」表示陽性，「－」表示陰性。3、16SrDNA序列同源性分析常規方法培養上述步驟一分離純化得到的普施特降解菌198-R-31，提取菌株的總DNA作為基因擴增模板，以細菌16SrDNA通用引物，27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492r：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′進行PCR反應。反應體系採用上海生物工程有限公司PCR擴增試劑盒。反應程序為：95℃變性30s、55℃退火1min、72℃延伸2min，共30個循環。DNA測序由北京三博遠志生物技術公司完成，序列拼接及相似性分析使用DNAStar軟體完成，基因比對通過美國國家生物技術信息中心NCBI資料庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)和EzTaxon在線完成。PCR基因擴增得到普施特降解菌198-R-31的16SrDNA基因片段約1.3kb，測定序列後與NCBI和EzTaxon資料庫中已公開的16SrDNA序列進行在線同源性比對，結果顯示普施特降解菌198-R-31與中間根瘤菌屬Mesorhizobiumamorphae(GenBank登錄號AF041442)同源性最高，達到99.85％。普施特降解菌198-R-31的16SrDNA序列詳見序列1。鑑於上述形態、生理生化特徵分析和16SrDNA序列同源性分析結果，將步驟一分離純化得到的普施特降解菌198-R-31鑑定為中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)。該普施特降解菌198-R-31已於2014年10月28日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號)，保藏編號為CGMCCNo.9865。普施特降解菌198-R-31的全稱為中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865，簡稱為中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31。實施例2、中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865降解普施特能力定量測定一、普施特測定標準曲線的繪製準確稱取普施特標準品(Fluka公司產品)10.0mg於10mL容量瓶中，用少量甲醇溶解，將容量瓶放在超聲波浴槽中振蕩10min，然後用甲醇定容至10mL，搖勻，配成1000mg/L普施特母液。然後繼續用甲醇稀釋獲得濃度分別為20、40、60、80、100mg/L的標準溶液。採用高效液相色譜(HPLC)測定不同濃度普施特標準品的峰面積，3次重複。以普施特濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪製普施特標準曲線，如圖1所示。檢測條件如下：檢測系統：Agilent1100Series。色譜柱：C18DiamosilTM反相柱，250mm×4.6mm，粒徑5μm。色譜條件：流動相：乙腈：水(冰乙酸調pH3.0)＝40:60(v/v)；檢測波長，258nm；流速，1.0mL/min；進樣體積，10μL；柱溫30℃所得普施特測定標準曲線：y＝24.482x-6.6979(R2＝0.9998)。其中，y為峰面積，x為普施特濃度。二、中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865降解普施特能力定量測定中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31處理：將中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865接種在牛肉膏蛋白腖固體培養基上培養24h，挑取1環接種在5mL牛肉膏蛋白腖液體培養基中，180r/min培養12h，離心去掉培養基，用無機鹽液體培養基調節到OD600值為1.0。吸取0.2mL菌懸液(1×109cfu/ml)接種到5mL含普施特100mg/L的無機鹽液體培養基(向無機鹽液體培養基中加入普施特(Fluka公司產品)使普施特的濃度為100mg/L得到的培養基)的試管中，28℃，180r/min培養7天，得到降解液。取4mL降解液至50mL離心管中，加入8mL二氯甲烷，振蕩2min，靜置10min，加入少許無水硫酸鈉。準確吸取800μL有機相轉移至1.5mLEP離心管中，在氮吹儀上吹乾，加入400μL甲醇(色譜級)，在超聲波清洗儀上溶解10min，用液譜過濾器過濾收集至樣品瓶中，按照上述HPLC法測定普施特。空白對照處理：同時，以未接種中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865的上述含普施特100mg/L的無機鹽液體培養基作為空白對照，按照上述方法測定普施特的濃度。普施特降解率：X＝(1-A/B)×100％，式中X為降解率(％)，A為中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31處理液中殘留的普施特濃度，B為未接菌空白對照處理液中殘留的普施特濃度。實驗設3次重複，每次重複每個處理接種10個試管。表3.中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.986降解普施特功效結果顯示，普施特初始濃度為100mg/L，7天後所述中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865對普施特的降解率達到84.62％(如表3所示)，這一結果表明，本發明所提供的中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865可降解普施特。