一種外周血幹細胞保存液及製備方法與流程

2023-07-03 12:18:51 1

本發明涉及幹細胞
技術領域：
，尤其涉及一種外周血幹細胞保存液及其製備方法。
背景技術：
：幹細胞治療是將具有不斷自我繁殖能力和多向化潛能的幹細胞在體外培養後，再將其移植入患者受損或缺損組織中，從而實現對損傷組織的補充和修復。自體外周血造血幹細胞移植是指對患有某些惡性血液病的患者進行化療加粒細胞集落刺激因子動員使患者自身外周血幹細胞達到一定值，再經過細胞分離機的採集，把採集出來的造血幹細胞冷凍保存，然後對患者進行放、化療處理，將冷凍保存的造血幹細胞經復甦後迅速輸給自己的移植方法，該方法具有採集簡便，患者痛苦少，移植後造血和免疫功能重建塊，併發症少等優點，目前已逐漸用於臨床。目前外周血幹細胞採集後，需要加入保存液進行冷凍保存，現有外周血幹細胞保存液，營養成分單一，配比不當，導致外周血幹細胞的細胞存活率低，細胞穩定性差。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是：針對現有技術的不足，提供一種配比適當，營養成分均衡，能提高細胞存活率，且能保持細胞穩定性的外周血幹細胞保存液。為解決上述技術問題，本發明的技術方案是：一種外周血幹細胞保存液，按照重量份數計包括以下組分：人血白蛋白3-8份、海藻糖2-4份、羥乙基澱粉1-3份、營養素5-15份、右旋糖酐1-3份、二甲基亞碸1-3份和適量水。作為一種改進的技術方案，所述外周血幹細胞保存液，按照重量份數計包括以下組分：白蛋白5-8份、海藻糖3-4份、羥乙基澱粉2-3份、營養素8-15份、右旋糖苷2-3份和二甲基亞碸2-3份和適量水。作為一種改進的技術方案，所述二甲基亞碸的質量濃度為5％-10％。作為一種改進的技術方案，所述外周血幹細胞保存液，按照重量份數計還包括1-3份0.5-2wt％的透明質酸和1-3份鏈黴素。作為一種改進的技術方案，所述營養素由維生素c、b族維生素、必需胺基酸、非必需胺基酸、氯化鈉、氯化鉀和葡萄糖酸鈉按照0.1-0.5:0.1-0.3:0.3-0.7:0.2-0.5:0.3-0.5:0.3-0.7:0.2-0.7的質量比組成。作為一種改進的技術方案，所述必需胺基酸為異亮氨酸、牛磺酸、精氨酸中任意一種或兩種。作為一種改進的技術方案，所述非必需胺基酸包括丙氨酸和/或酪氨酸。本發明所要解決的另一個技術問題是：針對現有技術的不足，提供一種外周血幹細胞保存液的製備方法。為解決上述技術問題，本發明的技術方案是：(1)按照比例依次將營養素、海藻糖和羥乙基澱粉溶於水中，混合均勻，得到的溶液在35-42℃條件下保溫，備用；(2)將步驟(1)中的溶液降溫至25-30℃，加入透明質酸，混勻，得到的混合液在25-30℃條件下保溫；(3)向步驟(2)的混合液中加入右旋糖酐和人血白蛋白，混勻後再加入鏈黴素，混合均勻，過濾，得到過濾液；(4)向步驟(3)的過濾液中加入質量濃度為5％-10％的二甲基亞碸，混勻，得到外周血幹細胞保存液。採用了上述技術方案後，本發明的有益效果是：(1)由於營養素中含有維生素c、b族維生素、無機鹽、必需胺基酸、非必需胺基酸多種營養組分，可維持細胞基本的生命代謝，平衡細胞的滲透壓；二甲基亞碸、透明質酸、羥乙基澱粉、海藻糖、右旋糖苷和人血白蛋白的聯合應用可實現對幹細胞通透性保護作用，降低細胞冰點，大大降低對幹細胞的損害，同時鏈黴素的加入可防止細胞復甦時滋生細菌，大大提高了幹細胞復甦時的存活率，使幹細胞最大限度保持細胞活性和穩定性，保存的幹細胞其存活率高於97％；(2)二甲基亞碸的用量少，濃度低，在發揮自身滲透性保護劑功能的同時，還降低了二甲基亞碸的毒性對細胞的危害，大大提高了臨床安全性；(3)保存液各組分明確，方便配置，適用於外周血幹細胞的低溫保存。具體實施方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。實施例1一種外周血幹細胞保存液，按照重量份數計包括以下組分：人血白蛋3份、海藻糖2份、羥乙基澱粉1份、營養素8份(維生素c、b族維生素、異亮氨酸、丙氨酸、氯化鈉、氯化鉀和葡萄糖酸鈉按照0.2:0.1:0.3:0.2:0.3:0.3:0.2的質量比組成)、右旋糖酐1份、二甲基亞碸1份(質量濃度為5％)和適量水。實施例2一種外周血幹細胞保存液，按照重量份數計包括以下組分：人血白蛋5份、海藻糖3份、羥乙基澱粉2份、營養素10份(維生素c、b族維生素、牛磺酸、酪氨酸、氯化鈉、氯化鉀和葡萄糖酸鈉按照0.2:0.1:0.4:0.3:0.3:0.3:0.3的質量比組成)、右旋糖酐2份、二甲基亞碸2份(質量濃度為5％)、2份0.5wt％的透明質酸、1份鏈黴素和適量水。上述保存液的製備方法：(1)按照比例依次將營養素、海藻糖和羥乙基澱粉溶於水中，混合均勻，得到的溶液在37℃條件下保溫，備用；(2)將步驟(1)中的溶液降溫至26℃，加入透明質酸，混勻，得到的混合液在26℃條件下保溫；(3)向步驟(2)的混合液中加入右旋糖酐和人血白蛋白，混勻後再加入鏈黴素，混合均勻，過濾，得到過濾液；(4)向步驟(3)的過濾液中加入質量濃度為5％-10％的二甲基亞碸，混勻，得到外周血幹細胞保存液。實施例3一種外周血幹細胞保存液，按照重量份數計包括以下組分：人血白蛋6.5份、海藻糖3.5份、羥乙基澱粉2.5份、營養素12份(維生素c、b族維生素、牛磺酸和精氨酸1:1的比例、酪氨酸、氯化鈉、氯化鉀和葡萄糖酸鈉按照0.3:0.2:0.5:0.4:0.3:0.4:0.5的質量比組成)、右旋糖酐2.5份、二甲基亞碸2.5份(質量濃度為7％)、2.5份1wt％的透明質酸、2份鏈黴素和適量水。實施例4一種外周血幹細胞保存液，按照重量份數計包括以下組分：人血白蛋8份、海藻糖4份、羥乙基澱粉3份、營養素15份(維生素c、b族維生素、牛磺酸和異亮氨酸按照1:1的比例、酪氨酸和丙氨酸按照1:1的比例、氯化鈉、氯化鉀和葡萄糖酸鈉按照0.4:0.3:0.5:0.4:0.5:0.5:0.7的質量比組成)、右旋糖酐3份、二甲基亞碸3份(質量濃度為9％)、3份1.8wt％的透明質酸、3份鏈黴素和適量水。對比例1一種外周血幹細胞保存液，與實施例3的唯一區別在於保存液中不含有透明質酸。對比例2一種外周血幹細胞保存液，與實施例3的唯一區別在於保存液中不含有牛磺酸、精氨酸和酪氨酸。對比例3一種外周血幹細胞保存液，與實施例3唯一的區別在於保存液中不含有右旋糖酐。應用例1實施例1-4中的保存液在外周血幹細胞保存中的應用對濰坊市人民醫院200名血液科的住院患者進行外周血幹細胞的採集，其中男性100名，女性100名，自體外周血幹細胞的動員採集使用聯合化療加重組人集落刺激因子，用細胞分選機採集外周血幹細胞，將實施例1-4的保存液和對比例1-3的保存液分別用於外周血幹細胞的保存，採用臺盼蘭拒染實驗來測定復甦後的活細胞數，結果見表1。細胞活率＝解凍後活細胞數/凍存前活細胞數×100表1實施例臺盼蘭拒染率(％)實施例195.7±0.5實施例297.5±1.5實施例398.2±0.7實施例497.2±1.3對比例182.3±0.7對比例278.6±1.5對比例380.6±1.2在顯微鏡下觀察細胞的聚集情況，細胞穩定良好，無團聚現象，結果表明採用本發明實施例1-4的保存液與對比例1-3的保存液對比，實施例1-4的保存液來保存外周血幹細胞，可使幹細胞保持較好的穩定性，而且大大提高了幹細胞活細胞數目，細胞存活率均在98％以上。以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。當前第1頁12