檢測脂蛋白相關磷脂酶a2的化學發光酶聯免疫試劑盒及其製備方法

2023-05-26 16:22:46 4

檢測脂蛋白相關磷脂酶a2的化學發光酶聯免疫試劑盒及其製備方法
【專利摘要】本發明公開了檢測脂蛋白相關磷脂酶A2的化學發光酶聯免疫試劑盒及其製備方法。本發明所提供的檢測脂蛋白相關磷脂酶A2的化學發光酶聯免疫試劑盒，包括包被有抗脂蛋白相關磷脂酶A2單克隆抗體的化學發光板，其特徵在於：還包括樣品處理液；所述樣品處理液主要由A液和B液組成；所述A液含有7.5g/L氯化銨、1.2g/L酪蛋白和1.2g/L硬脂酸鈉；所述B液含有0.5M?Tris-Hcl，PH7.6。為最大限度減低Lp-PLA2發光檢測噪音，本發明的試劑盒中還包括獨特的血液樣品處理劑配方，有助於淬滅非特異性光源，大大增強檢測光與本底雜光的差別，增加檢測特異性。
【專利說明】檢測脂蛋白相關磷脂酶A2的化學發光酶聯免疫試劑盒及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及化學發光酶聯免疫技術檢測領域，尤其涉及檢測脂蛋白相關磷脂酶A2的化學發光酶聯免疫試劑盒及其製備方法。
【背景技術】
[0002]脂蛋白相關磷脂酶A2 (Lp-PLA2)是磷酸脂酶A2超家族中的非鈣離子依賴型磷酸脂酶，最初發現其可以降解血小板活化因子，曾被稱為血小板活化因子乙醯水解酶。1995年首次被克隆，其編碼基因(PLA2G7)，有12個外顯子，染色體定位於6p21.2212，由441個胺基酸殘基組成的一種絲氨酸脂酶，相對分子質量為50X 103(50kDa)。Lp_PLA2以生物膜磷脂為天然底物優先作用於氧化磷脂sn22位上短脂醯鏈中的酯鍵，使水溶性強的磷脂產生游離脂肪酸和溶血磷脂參與磷脂的代謝。
[0003]循環中Lp-PLA2主要來源於血細胞，如單核細胞、巨噬細胞、T淋巴細胞和肥大細胞受炎症刺激時少量分泌，並受炎性介質的調節，如、2幹擾素和脂多糖抑制其分泌，血小板活化因子促進其分泌。聯合應用原位雜交和免疫組織化學技術研究發現，兔和人動脈粥樣硬化斑塊中的巨噬細胞可表達更高水平的Lp-PLA2mRNA和蛋白。人血漿中的Lp_PLA2與脂蛋白顆粒結合的形式存在，其中2/3與低密度脂蛋白(low density lipop rotein, LDL)結合，主要是小而密的LDL結合，其中帶負電荷的LDL中的Lp-PLA2含量和活性更高，促進內皮細胞趨化因子釋放，促進炎症反應。1/3與高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)和極低密度脂蛋白(very low density lipop rotein, VLDL)結合。Lp-PLA2與人類HDL結合少的原因，可能是由於人Lp-PLA2氨基端的高度糖基化阻礙了其與HDL的結合 ?
[0004]目前實驗研究及流行病學研究結果揭示了Lp-PLA2生成多種促炎產物，參與從動脈粥樣斑塊形成到斑塊不穩定的各個階段，具有促進炎症反應作用，可能成為新的心腦事件獨立預測因子。血漿Lp-PLA2測量是一個有價值的方法，可用來鑑別或預測具有心腦血管疾病高風險事件的個體。
[0005]目前為止，沒有見到利用Lp-PLA2與心腦血管疾病之間的相關關係來製備檢測人Lp-PLA2的水平的試劑盒的報導。

【發明內容】

[0006]本發明根據上述領域存在的空白和需求，提供了檢測脂蛋白相關磷脂酶A2的化學發光酶聯免疫試劑盒及其製備方法。
[0007]本發明的一個目的是提供檢測脂蛋白相關磷脂酶A2的化學發光酶聯免疫試劑盒。
[0008]本發明所提供的檢測脂蛋白相關磷脂酶A2的化學發光酶聯免疫試劑盒，包括包被有抗脂蛋白相關磷脂酶A2單克隆抗體的化學發光板，還包括樣品處理液；所述樣品處理液主要由A液和B液組成；所述A液含有7.5g/L氯化銨、1.2g/L酪蛋白和1.2g/L硬脂酸鈉；所述 B 液含有 0.5M Tris-Hcl, PH7.6。
[0009]所述試劑盒還包括樣品稀釋液；所述樣品稀釋液由如下方法製備得到:將100ml山羊血清、20ml重量百分比濃度為1%的硫柳汞、10ml0.1M鐵氰化鉀、0.5ml吐溫-20、10mll0mg/ml的慶大黴素、以及餘量為PH7.40.01M PBS緩衝液定容至1000ml，即得到所述
樣品稀釋液。
[0010]所述試劑盒還包括濃縮洗滌液；所述濃縮洗滌液由如下方法製備得到:將
2.96gNaH2P04.2H20、29g Na2HP04.12H20、234g NaCl 和 20ml 吐溫-20，加雙蒸水定容至1000ml，即得到濃縮洗滌液。
[0011]所述試劑盒還包括化學發光底物液；所述化學發光底物液由化學發光底物液R1和化學發光底物液R2組成；所述化學發光底物液R1為3.0mmol/L魯米諾與0.3mmol/L對碘苯酚的混合液；化學發光底物液R2為7.5mmol/L的雙氧水。
[0012]所述試劑盒還包括標準品溶液；所述標準品溶液為6個濃度梯度的脂蛋白相關磷脂酶 A2 抗原，所述濃度依次為:0ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml 和 lOOOng/ml ο
[0013]所述試劑盒還包括高值對照液和低值對照液；所述高值對照液或低值對照液由向胎牛血清中添加重組脂蛋白相關磷脂酶Α2製備得到；所述高值對照的終濃度為700ng/ml ；所述低值對照的終濃度為300ng/ml。
[0014]本發明的另一個目的是提供所述檢測脂蛋白相關磷脂酶A2的化學發光酶聯免疫試劑盒的製備方法。
[0015]本發明所提供的所述檢測脂蛋白相關磷脂酶A2的化學發光酶聯免疫試劑盒的製備方法，包括如下步驟:
[0016](1)製備抗體包被液:0.36g NaH2P04.Η20，3.10g Na2HP04.2Η20，定容至 lL，pH7.6 ；
[0017](2)包被；
[0018](3)封閉；
[0019]其特徵在於:還包括製備樣品處理液的步驟:將7.5g氯化銨、1.2g酪蛋白和1.2g硬脂酸鈉，加入純化水定容1L，即得到A液；PH7.6,0.5M Tris-HCl溶液為B液；將所述A液和B液分別獨立包裝，即得到所述樣品處理液。
[0020]所述包被的條件為2_8°C、18-24小時。
[0021]所述封閉的條件為4°C封閉12小時。
[0022]所述封閉採用的封閉液由如下方法製備得到:向PH值為7.0-7.5、濃度為10mM的Tris緩衝液中加入質量百分比終濃度2%的蘇氨酸、質量百分比終濃度1%的蔗糖、質量百分比終濃度0.5%的β -巰基乙醇。
[0023]本發明採用抗Lp-PLA2單克隆抗體包被空白化學發光板，得到檢測Lp_PLA2的化學發光酶聯免疫試劑盒的核心部件化學發光板。使用時，可按照常規化學發光酶聯免疫檢測的方法配置其它所需試劑與所述化學發光板配合使用。本發明優選提供試劑盒盒內還放置有其它盛裝著化學發光酶鏈免疫反應所需試劑的部分或全部試劑瓶的試劑盒方案，便於檢測反應。該試劑盒可用於鑑別或預測具有心腦血管疾病高風險事件的個體。從實施例可以看出，本發明試劑盒對於Lp-PLA2的最低檢測限可低至0.1ng/mL。[0024]為最大限度減低Lp-PLA2發光檢測噪音，本發明的試劑盒中還包括獨特的血液樣品處理劑配方，有助於淬滅非特異性光源，大大增強檢測光與本底雜光的差別，增加檢測特異性。
【具體實施方式】
[0025]本發明的檢測脂蛋白相關磷脂酶A2化學發光酶聯免疫試劑盒包括:
[0026]化學發光板(包被有抗脂蛋白相關磷脂酶A2單克隆抗體的96微孔或48微孔的化學發光板)、樣品處理液(A液+B液)、其它盛裝著化學發光酶鏈免疫反應所需試劑的試劑瓶——(抗Lp-PLA2酶結合物、標準品6瓶、Lp-PLA2高值對照、Lp-PLA2低值對照、樣品稀釋液、化學發光底物液R1、化學發光底物液R2、洗滌液(20x濃縮)各1瓶)、說明書一份，不乾膠紙片2張。
[0027]抗脂蛋白相關磷脂酶A2單克隆抗體(Lp-PLA2單克隆抗體)購自天津勝發生物技術有限公司。
[0028]實施例1、檢測脂蛋白相關磷脂酶A2的化學發光酶聯免疫試劑盒製備及其檢測方法
[0029]一、製備檢測脂蛋白相關磷脂酶A2的化學發光酶聯免疫試劑盒
[0030]1、樣本處理液的配製
[0031]樣品處理液配方:由A液和B液組成，其中A液為7.5g氯化銨，1.2g酪蛋白，1.2g硬脂酸鈉，加入純化水定容1L，即A液中含有7.5g/L氯化銨、1.2g/L酪蛋白和1.2g/L硬脂酸鈉液為 0.5M Tris-HCl 溶液(PH7.6)。
[0032]2、包被抗Lp-PLA2單克隆抗體為化學發光反應板
[0033]以下抗體包被液的配方為:
[0034]0.36g NaH2P04.H20, 3.10g Na2HP04.2H20,定容至 1L, pH7.6。
[0035]酶標板選乳白色不透明聚苯乙烯96孔化學發光酶標板(英國Porvair,96孔板)。
[0036]抗體檢測板的最佳製備條件為，使用包被單克隆抗體以最佳包被抗體濃度進行包被，用50mM pH值為7.6的磷酸鹽緩衝液配製成包被濃度為2 μ g/ml的Lp_PLA2單抗包被液，並將包被液負載於微孔板(100 μ 1/孔)，2-8°C包被18-24小時。
[0037]加入封閉液，300 μ 1/孔，4°C封閉12小時，隨後棄去封閉液拍幹，室溫乾燥4小時。乾燥後的化學發光板，迅速真空封口包裝，將封裝好的板存於2-8°C。所述封閉採用的封閉液配方為:pH值為7.0-7.5，濃度為10mM的Tris緩衝液中加入質量百分比終濃度2%的蘇氨酸、質量百分比終濃度1%的蔗糖、質量百分比終濃度0.5%的β -巰基乙醇。
[0038]3、標準品的製備:將重組全長Lp_PLA2抗原(美國abnova公司)用蛋白穩定劑(北京科躍中楷生物技術有限公司)稀釋成6個梯度濃度，分別是:0ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml 和 1000ng/ml。
[0039]4、樣品稀釋液、濃縮洗滌液的配製:
[0040]A、樣品稀釋液
[0041]山羊血清100ml (Biotopped, 100ml/瓶)
[0042]1%(重量比)硫柳汞 20ml (EYSIN，lkg)
[0043]0.1M 鐵氰化鉀 10ml (acros, 100g/ 瓶)[0044]吐溫-200.5ml (amres, 500ml/ 瓶)
[0045]lOmg/ml 慶大黴素 10ml (sigma, 500mg/ 瓶)
[0046]加0.01M PBS (PH7.4)定容至 1000ml，過濾除菌，4°C保存。
[0047]B、洗滌液(20倍濃縮)
[0048]NaH2P04.2Η202.96g (北京化學試劑公司，500g/ 瓶)
[0049]Na2HP04.12H2029g (北京化學試劑公司，500g/ 瓶)
[0050]NaC1234g (北京化學試劑公司，500g/瓶)
[0051]吐溫-2020ml(amres, 500ml/瓶)
[0052]加雙蒸水定容至1000ml，過濾除菌，4°C保存。
[0053]5、化學發光底物的製備
[0054]化學發光體系由發光劑(魯米諾，sigma)、增強劑(對碘苯酹,duly)及雙氧水(上海實驗試劑有限公司)構成。化學發光底物液由化學發光底物液R1和化學發光底物液R2組成。
[0055]化學發光底物液R1為3.0mmol/L魯米諾與0.3mmol/L對碘苯酹的混合液,化學發光底物液R2為7.5mmol/L的雙氧水。
[0056]6、高值對照和低值對照的製備
[0057]胎牛血清(gibco, 500ml/瓶)中添加一定量的重組Lp_PLA2抗原蛋白(美國abnova公司)，高值對照的終濃度為700ng/ml,低值對照的終濃度為300ng/ml,過濾除菌。
[0058]二、試劑盒的應用及測操作程序
[0059](1)平衡:從冷藏環境中取出試劑及樣品，置於室溫(18_25°C )平衡約30分鐘。
[0060](2)樣品處理:將樣品處理液中的A液和B液混合，然後取充分混勻的待檢全血樣本25 μ 1加入200 μ 1樣品處理液中，震蕩混勻。
[0061](3)配液:將濃縮洗滌液用蒸餾水作20倍稀釋成工作濃度洗滌液，如產生結晶，應待其於室溫溶解後再稀釋。
[0062](4)加樣:取96孔化學發光酶標板，預設置空白、低值對照、高值對照各3孔。每孔中先加入50 μ 1樣品稀釋液(空白對照每孔加入100 μ 1樣品稀釋液)；然後低、高值對照孔加入50μ 1低、高值對照，其餘孔按設定各加入50μ 1待測樣品；加樣完畢後用不乾膠封片封蓋反應板，37°C振蕩孵育60分鐘。
[0063](5)洗板:甩去板孔中的液體，在吸水紙上拍幹；用工作濃度洗滌液洗板6次，最後拍幹。
[0064](6)加酶結合物:每孔加入100 μ 1酶結合物(辣根過氧化酶標記的羊抗人Lp-PLA2抗體)，用不乾膠封片封蓋反應板,37°C孵育30分鐘。
[0065](7)洗板:同(5)。
[0066](8)加底物:每孔先後加入化學發光底物液R1、化學發光底物液R2各50 μ 1，避光顯色至少2分鐘。
[0067](9)測定:加發光底物液後2?30分鐘在化學發光儀上讀出各孔相對發光度(RLU)。用所獲得的每個濃度的標準品溶液的發光強度平均值(Β)除以第一個標準溶液(0標準)的發光強度值(Β0)再乘以100%，即百分發光值。計算公式為:百分發光值(%) = (Β/Β0)X100%。[0068](10)以Lp-PLA2標準品溶液的濃度(ng/mL)的半對數值為x軸，百分發光值為Y軸，繪製標準曲線圖。用同樣的辦法計算樣品溶液的百分發光值，相對應每一個樣品的濃度則可從標準曲線上讀出樣本中Lp-PLA2的含量。本發明中檢測結果的分析也可以採用回歸方程法，計算出樣品溶液濃度。本發明中檢測結果的分析還可以利用計算機專業軟體，此法更便於大量樣品的快速分析。
[0069]實施例2、含有樣品處理液的試劑盒與不含有樣品處理液的試劑盒比較
[0070]實驗組:樣品經本發明樣品處理液處理
[0071]對照組:樣品未經處理。
[0072]以上述實驗組和對照組進行對比試驗。對正常對照樣本100例，患心腦血管疾病樣本100例採用實驗組和對照組進行平行檢測，檢測方法參見上述實施例1，檢測程序和結果判斷嚴格按照各試劑說明書進行。檢測結果如表1、表2和表3所示:
[0073]表1對照組試劑盒測定結果
[0074]
【權利要求】
1.一種檢測脂蛋白相關磷脂酶A2的化學發光酶聯免疫試劑盒，包括包被有抗脂蛋白相關磷脂酶A2單克隆抗體的化學發光板，其特徵在於:還包括樣品處理液；所述樣品處理液主要由A液和B液組成；所述A液含有7.5g/L氯化銨、1.2g/L酪蛋白和1.2g/L硬脂酸鈉；所述 B 液含有 0.5M Tris-Hcl, PH7.6。
2.根據權利要求1所述的檢測脂蛋白相關磷脂酶A2的化學發光酶聯免疫試劑盒，其特徵在於:所述試劑盒還包括樣品稀釋液；所述樣品稀釋液由如下方法製備得到:將100ml山羊血清、20ml重量百分比濃度為1%的硫柳汞、10ml0.1M鐵氰化鉀、0.5ml吐溫-20、10mll0mg/ml的慶大黴素、以及餘量為PH7.40.01M PBS緩衝液定容至1000ml，即得到所述樣品稀釋液。
3.根據權利要求2所述的檢測脂蛋白相關磷脂酶A2的化學發光酶聯免疫試劑盒，其特徵在於:所述試劑盒還包括濃縮洗滌液；所述濃縮洗滌液由如下方法製備得到:將2.96gNaH2P04.2H20、29g Na2HP04.12H20、234g NaCl 和 20ml 吐溫-20，加雙蒸水定容至1000ml，即得到濃縮洗滌液。
4.根據權利要求3所述的檢測脂蛋白相關磷脂酶A2的化學發光酶聯免疫試劑盒，其特徵在於:所述試劑盒還包括化學發光底物液；所述化學發光底物液由化學發光底物液R1和化學發光底物液R2組成；所述化學發光底物液R1為3.0mmol/L魯米諾與0.3mmol/L對碘苯酚的混合液；化學發光底物液R2為7.5mmol/L的雙氧水。
5.根據權利要求4所述的檢測脂蛋白相關磷脂酶A2的化學發光酶聯免疫試劑盒，其特徵在於:所述試劑盒還包括標準品溶液；所述標準品溶液為6個濃度梯度的脂蛋白相關磷脂酶 A2 抗原，所述濃度依次為:0ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml 和 1000ng/ml ο
6.根據權利要求5所述的檢測脂蛋白相關磷脂酶Α2的化學發光酶聯免疫試劑盒，其特徵在於:所述試劑盒還包括高值對照液和低值對照液；所述高值對照液或低值對照液由向胎牛血清中添加重組脂蛋白相關磷脂酶Α2製備得到；所述高值對照的終濃度為700ng/ml ；所述低值對照的終濃度為300ng/ml。
7.權利要求1-6中任一所述檢測脂蛋白相關磷脂酶A2的化學發光酶聯免疫試劑盒的製備方法，包括如下步驟:(1)製備抗體包被液:0.36g NaH2P04.Η20，3.10g Na2HP04.2H20，定容至 1L，pH7.6 ；(2)包被；(3)封閉；其特徵在於:還包括製備樣品處理液的步驟:將7.5g氯化銨、1.2g酪蛋白和1.2g硬脂酸鈉，加入純化水定容1L，即得到A液；PH7.6、0.5M Tris-HCl溶液為B液；將所述A液和B液分別獨立包裝，即得到所述樣品處理液。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於:所述包被的條件為2-8°C、18-24小時。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於:所述封閉的條件為4°C封閉12小時。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於:所述封閉採用的封閉液由如下方法製備得到:向PH值為7.0-7.5、濃度為10mM的Tris緩衝液中加入質量百分比終濃度2%的蘇氨酸、質量百分比終濃度1%的蔗糖、質量百分比終濃度0.5%的β -巰基乙醇。
【文檔編號】G01N33/531GK103645326SQ201310683802
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月13日 優先權日:2013年12月13日
【發明者】吳凡, 焦守恕 申請人:同昕生物技術（北京）有限公司