應用dna條形編碼鑑定雞品種的方法
2023-05-26 09:43:16 2
專利名稱：應用dna條形編碼鑑定雞品種的方法
技術領域：
本發明涉及應用DNA條形編碼鑑定雞品種的方法，具體的說應用DNA測序技術測定線粒體細胞色素C氧化酶I(cytochrome C oxidase I COI)基因序列，利用COI這一特定基因的特定區段作為DNA條形碼鑑定雞品種，屬於分子生物學技術領域。
背景技術：
由於我國家禽品種市場還欠規範，培育的品種良莠不齊，假冒偽劣、以次充好的現象時有發生，目前對家禽品種的鑑定主要是以形態學標記為依據來審查育種檔案和進行生產性能測定，隨著育種水平的不斷提高，親本與雜交後代的外貌特徵有較大的相似性，比如以地方雞種為父本、與隱性白羽雞母本進行雜交，其雜交子一代與地方雞種就特別相似，很難從外貌特徵進行區分。現代的專門化品系主要注重生產性能，品系的外貌特徵並不一定完全一致，比如國外引進的高產蛋雞，通過羽色鑑別的商品代母雞背部條紋有多種表現型，因此其品系間的鑑定不能簡單地通過外貌來進行區分，所以利用形態學標記來進行家禽品種(品系)鑑定就不夠科學。如果進行生產性能測定，不僅要花費較長時間(蛋雞及種雞約72周，肉種雞約66周，肉雞商品代約14周)，而且成本也很高，測定的結果還要受飼養各個環節因素的影響，難以準確反映各品系的種質特性。而用同工酶和蛋白質標記鑑定只能間接反映品種的極少部分DNA的多態性。因此，上述這些方法不能科學、準確地進行家禽品種的鑑定，而且鑑定時間長，成本也很高。
發明內容
本發明的目的就是要克服傳統的品種鑑定方法存在的準確性差、成本高以及鑑定時間長等方面的缺陷，發明一種科學、準確的雞品種鑑定方法。
本發明的技術方案是這樣實現的應用DNA條形編碼鑑定雞品種的方法，其特徵是利用DNA測序技術測定受測雞群體與標準對照樣品的線粒體細胞色素C氧化酶I(cytochrome C oxidase I COI)基因序列，根據測序的COI序列中的突變位點、單倍型、單倍型多樣度(Hd)、核苷酸多樣度(Pi)、品種間雙參數模型遺傳距離、品種間核苷酸分歧度、各品種的特異位點及品種的DNA分類圖進行雞品種鑑定，其步驟是(1)對受測雞品種與標準對照樣品隨機抽取血樣，用酚-氯仿法提取基因組DNA；(2)按照中國紅色原雞mt DNA COI中的保守區設計引物；(3)利用設計的引物對所鑑定雞群的mt DNACOI進行PCR擴增，將PCR擴增產物進行回收，並在ABI 3730測序儀上進行雙向測序；(4)對測序結果進行序列讀取和比對；(5)統計單倍型、平均核苷酸差異和核苷酸多樣度、核苷酸分歧度、淨遺傳距離和核苷酸變異位點，確定是品種間變異還是品種內變異；(6)根據mtDNA COI序列按照UPGMA法進行聚類，確定是否屬於同一品種或同一群體。
所述的隨機抽取血樣的受測雞種與標準對照樣品雞種中樣品數量為12隻個體，母雞與公雞的比例為1∶1。
由於線粒體DNA細胞色素氧化酶COI基因在同一物種中具有相對的保守性，又有足夠的變異可區分不同的品種，它揭示的是遺傳物質DNA的差異，與應用表型性狀、生產性能、生化標記和其他遺傳標記等方法相比，更能真實的反映品種間的差異。利用DNA條形編碼鑑定雞品種的方法，其結果可作為鑑定雞品種真偽的科學依據。
具體實施例方式
(1)對受測雞品種與標準對照樣品中隨機抽取6隻公雞，6隻母雞，翅靜脈採血，血樣用酚-氯仿法提取基因組DNA；(2)按照Gen Bank上發表的中國紅色原雞mt DNA COI(序列號)中的保守區設計3對引物；(3)利用3對引物對所鑑定雞群的mt DNA COI進行PCR擴增，將PCR擴增產物進行回收和在ABI 3730測序儀上進行雙向測序；(4)測序通過Chromas軟體讀取，並對每個測序結果進行人工逐個鹼基讀取和反覆校對，並通過雙向重複測序進行校正，所獲序列用CLUSTALW軟體進行比對，並且與GenBank雞(Gallus Gallus)屬線粒體COI基因序列進行比較，用MEGA3.0軟體中的Kimura雙參數法計算遺傳距離。應用鄰接法(NJ)構建進化系統樹。應用DNAsp 4.10統計單倍型、平均核苷酸差異和核苷酸多樣度、核苷酸分歧度、淨遺傳距離和核苷酸變異位點等；(5)根據受測雞種和標準對照雞品種COI基因序列的單倍型、平均核苷酸差異和核苷酸多樣度、核苷酸分歧度和淨遺傳距離，確定雞品種內及品種間COI基因序列變異程度。如果平均變異小於2％，則為同一品種，大於2％則為不同品種；(6)根據兩者的COI基因序列的特異位點的差異，判定是否為同一雞種；(7)用Mega3.0軟體，根據mtDNA COI序列按照UPGMA法進行聚類，若受測定雞中與標準對照雞種聚為一類則為同一品種，否則為不同品種。
權利要求
1.應用DNA條形編碼鑑定雞品種的方法，其特徵是利用DNA測序技術測定受測雞群體與標準對照樣品的線粒體細胞色素C氧化酶I(cytochrome C oxidase I COI)基因序列，根據測序的COI序列中的突變位點、單倍型、單倍型多樣度(Hd)、核苷酸多樣度(Pi)、品種間雙參數模型遺傳距離、品種間核苷酸分歧度、各品種的特異位點及品種的DNA分類圖進行雞品種鑑定，其步驟是(1)對受測雞品種與標準對照樣品隨機抽取血樣，用酚-氯仿法提取基因組DNA；(2)按照中國紅色原雞mt DNA COI中的保守區設計引物；(3)利用設計的引物對所鑑定雞群的mt DNACOI進行PCR擴增，將PCR擴增產物進行回收，並在ABI 3730測序儀上進行雙向測序；(4)對測序結果進行序列讀取和比對；(5)統計單倍型、平均核苷酸差異和核苷酸多樣度、核苷酸分歧度、淨遺傳距離和核苷酸變異位點，確定是品種間變異還是品種內變異；(6)根據mtDNA COI序列按照UPGMA法進行聚類，確定是否屬於同一品種或同一群體。
2.根據權利要求1所述的應用DNA條形編碼鑑定雞品種的方法，其特徵是所述的隨機抽取血樣的受測雞種與標準對照樣品雞種中樣品數量為12隻個體，母雞與公雞的比例為1∶1。
全文摘要
應用DNA條形編碼鑑定雞品種的方法屬於分子生物學技術領域。本發明的技術方案是這樣實現的利用DNA測序技術測定受測雞群體與標準對照樣品的線粒體細胞色素C氧化酶I(cytochrome C oxidase I COI)基因序列，根據測序的COI序列中的突變位點、單倍型、單倍型多樣度(Hd)、核苷酸多樣度(Pi)、品種間雙參數模型遺傳距離、品種間核苷酸分歧度、各品種的特異位點及品種的DNA分類圖進行雞品種鑑定。與應用表型性狀、生產性能、生化標記和其他遺傳標記等方法相比，本發明更能真實的反映品種間的差異。其結果可作為鑑定雞品種真偽的科學依據。
文檔編號C12Q1/68GK101016565SQ20071002005
公開日2007年8月15日 申請日期2007年2月9日 優先權日2007年2月9日
發明者高玉時, 屠雲潔, 鄒劍敏, 王克華, 童海兵, 顧榮 申請人:江蘇省家禽科學研究所