一種種子特異型表達載體及其構建方法與應用的製作方法

2023-05-26 20:43:26

專利名稱：一種種子特異型表達載體及其構建方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種種子特異型表達載體及其構建方法與應用，特別是涉及一種種子 特異型表達載體及其構建方法和利用該載體在油葵中製備阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體的 方法。
背景技術：
心血管疾病是全球範圍導致人類死亡最主要的原因，預計到2015年，約有2000萬 人死於心血管疾病。諸多的心血管疾病(如心肌梗塞和中風)為動脈粥樣硬化的主要合併 症。動脈粥樣硬化的發病機制目前尚不完全清楚，血脂代謝異常是造成該疾病的主要危險 因素之一，其中高水平的低密度脂蛋白(low density lipoproteins，LDL)和低水平的高 密度脂蛋白(highdensity lipoproteins, HDL)是兩個最重要的危險因素。傳統的治療策 略是降低血漿中總膽固醇(total cholesterol,TC)和低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoproteins cholesterol,LDL-C)的含量，他汀類是目前首選的降脂藥物，但該類藥物不 能清除已沉積在動脈壁上的斑塊，也不能達到根本治療動脈粥樣硬化症的目的。各國學者 越來越多地把目光轉向另一個危險因素-低水平的高密度脂蛋白，流行病學研究表明血 漿中高密度脂蛋白的水平與冠心病的發病率成負相關，認為高密度脂蛋白能起到防止動脈 粥樣硬化形成的作用。通過提升高密度脂蛋白的水平來治療動脈粥樣硬化症-這是世界醫 藥行業正在浮現的一種新的針對急性冠狀動脈粥樣硬化疾病治療的新方法，被稱為高密度 脂蛋白靶向治療。阿樸脂蛋白A-KapolipoproteinA-LapoA-I)是高密度脂蛋白主要的蛋 白成分。阿樸脂蛋白A-I在肝臟和小腸內合成，其原始翻譯產物是含有267個胺基酸殘基 的前原蛋白形式(preproapoA-I)。前原蛋白被信號肽酶加工切除18肽前片段轉變成原阿 樸脂蛋白形式(ProapoA-I)，原阿樸脂蛋白分泌出胞外後，在細胞外特異性轉化酶作用下切 除6肽原片段(Arg-His-Phe-Trp-Gln-Gln)，轉變成血漿成熟阿樸脂蛋白A-I。阿樸脂蛋白 A-I的作用機理主要是促進膽固醇的外溢、抗氧化和抗血小板聚合等。阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體(apolipoproteinA-IM，apoA-IM)是阿樸脂蛋白A-I 的自然突變體(Argl73--Cys)，與阿樸脂蛋白A-I相比，173位精氨酸的丟失導致其α螺 旋含量降低，加大了與脂質結合的能力。阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體易形成二聚體(Α-ΙΜ/ Α-ΙΜ)，此二聚體激發膽固醇逆向轉運的效率要比阿樸脂蛋白A-I高，從而更高效地加速膽 固醇的排出；同時阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體比阿樸脂蛋白A-I能更好地削弱低密度脂蛋 白的氧化。目前，阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體是世界上唯一被證實的能夠清除已經沉積在 動脈壁上血栓的藥用蛋白，具有十分廣闊的應用前景。最近《美國醫學會雜誌》報導阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體對動脈粥樣病變改變的 速度和幅度前所未有，並且幾乎沒有副作用，應用前景十分廣闊，已成為世界醫藥研發領域 工作的重點和競爭的焦點。全球最大的醫藥公司輝瑞(Pfizer)預測任何能夠逆轉冠狀動 脈斑塊的藥物都有可能取得10億美元的銷售業績，所以阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體的開發 必然可以帶來巨大的經濟效益和社會效益，同時也會增強我國在心血管疾病和動脈粥樣硬化疾病藥物開發領域的世界影響力。此外，基於小樣本臨床結果顯示阿樸脂蛋白A-I的臨床需要量是每個療程 5_6g，阿樸脂蛋白A-I的高治療劑量以及動脈粥樣硬化的高患病率均預示了一個強大的 市場需求，這也為阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體的開發提供了一個契機。目前，美國愛普隆 (Esperion)公司生產實驗試劑用途的阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體，但其採用的是生物合成 的方法，生產的成本高，產量小，不適合規模化生產。細菌系統內蛋白質的重組體表達一般 具有吸引力，但是此方法產率低，並且大腸桿菌內毒素與阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體易形 成強的複合體，蛋白純化方法昂貴且安全性較差。因此，開發高產、高效生產阿樸脂蛋白A-I 米蘭突變體的方法勢在必行。植物生物反應器(plant bioreactor)也被稱為分子藥田(Molecular medicine farming)是指利用植物生物系統大規模生產具有重要應用和商業價值的外源蛋白質，特別 是用於醫療和診斷的藥用蛋白。1989年哺乳動物抗體在轉基因植物中首次獲得成功表達， 其重鏈和輕鏈在轉基因菸草中表達並正確組裝，首次證實了植物作為生物反應器的可行 性。此後，轉基因植物研究逐漸興起。許多其它的藥用蛋白陸續在各種不同的植物中實現 了表達，如水蛭素、幹擾素、人血清蛋白、功能抗體，已用於植物生物反應器研究的植物有 菸草、擬南芥、大豆、小麥、水稻、玉米、油菜、馬鈴薯和番茄等。目前，加拿大針對代謝及心血管疾病研製蛋白質藥物組合的生物科技公司 SemBioSysGenetics公司在中國申請了轉基因紅花和擬南芥生產阿樸脂蛋白A-I和阿樸脂 蛋白A-I米蘭突變體方法的專利(CN1906^6A)，把嵌合核酸構建體導入擬南芥或紅花中， 結籽後在種子中表達阿樸脂蛋白A-I及阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體。擬南芥是一年生或 兩年生草本植物，其基因組是目前已知植物基因組中最小的，並且因為其基因高度純合，用 理化因素處理突變率很高，容易獲得各種代謝功能的缺陷型，成為了遺傳學研究的好材料， 被科學家譽為「植物中的果蠅」。但是，擬南芥目前廣泛被用於實驗途徑，並未有大規模的 普遍種植形成。紅花屬一年生草本植物，種子可以榨油，是一種重要的油料作物，分布在溫 帶，我國多產於西北，尤以新疆、西藏為多，其次是華北和東北地區。但紅花畝產量比較低 (120-150kg)，瘦果含油率不是很高(34 55% )，導致最終產物蛋白的量少，成本較高。因此，現有技術仍然需要一種方法穩定、產率高、成本低、步驟簡單的製備阿樸脂 蛋白A-I和阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體的方法。

發明內容
本發明的申請人通過長期研究，付出大量的創造性勞動，通過構建一種特異型的 表達載體，並選擇油葵作為生物反應器，穩定、高效地生產出阿樸脂蛋白A-I和阿樸脂蛋白 A-I米蘭突變體，從而完成了本發明。本發明涉及以重組DNA技術生產阿樸脂蛋白A-I或阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體的 方法，特別涉及以油葵作為宿主生產阿樸脂蛋白A-I或阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體的方法。 具體的說，本發明涉及利用花生油體蛋白與阿樸脂蛋白A-I或阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體 的融合蛋白基因在油葵油體中表達從而可以大量生產製備治療動脈粥樣硬化極其所造成 的心血管疾病的重要藥物阿樸脂蛋白A-I和阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體，優選製備阿樸脂 蛋白A-I米蘭突變體。
首先，本發明提供了一種種子特異型表達載體，含有阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體 與花生油體蛋白融合基因或含有阿樸脂蛋白A-I與花生油體蛋白融合基因，優選含有阿樸 脂蛋白A-I米蘭突變體與花生油體蛋白融合基因，其中，該載體的啟動子為油菜油體蛋白 基因啟動子。以上載體用以在油葵中製備阿樸脂蛋白A-I或阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體， 優選阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體。另外，本發明還提供了一種構建上述高效種子特異型表達載體的方法，包括如下 步驟1)分離克隆油菜油體蛋白基因啟動子和花生油體蛋白基因；2)按照植物偏愛的密碼子設計合成阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因或阿樸脂蛋 白A-I基因；3)構建以油菜油體蛋白基因啟動子驅動的花生油體蛋白與阿樸脂蛋白A-I米蘭 突變體或阿樸脂蛋白A-I基因融合表達的植物表達載體。具體步驟包括1)躺雄舊艦口靴艦艦用PCR方法自油菜 (Brassica campestris)基因組DNA中擴增20kD油體蛋白基因的啟動子，並將該啟動子克 隆到pUC19 (購自MBI公司)上得到重組質粒pUCN，以花生基因組DNA為模板PCR方法擴增 終止密碼子缺失的花生油體蛋白基因。其中，油菜品種可以是目前現有技術中已經公開或 使用的油菜品種，例如，可以是青油14品種、互豐101、耐寒高油王、早油100天和秦油2號 等，優選青油14品種。以上油菜油體蛋白啟動子可以克隆到PUC19的適合位點之間，優選 克隆到pUC19的HindIII和BamHI位點之間。所述的花生品種可以是目前現有技術中已經 公開或使用的花生品種，例如，可以是冀花4號、冀油7號、白沙、魯花11、海花和豐花1號 等，優選冀花4號。2)勿偏愛的密石馬子設i十合成阿樸)^ 白A-I或阿樸)^ 白A-I米蘭突變 體基因桉照油葵密碼子使用頻率優化阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體或阿樸脂蛋白A-I基因， 優選優化的基因為阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因。頻率小於10%的密碼子一律認為 是稀有密碼子被排除，其餘的各密碼子按油葵密碼子使用頻率優化，優化前基因的分子量 為451. 4，優化前後序列的一致性為大於60%，優選大於65%，最優選為72%，優化後基因 的分子量優選為451. 3。油葵密碼子使用頻率可參考http://VWW. kazusa. or. jp/codon/ cgi-bin/showcodon. cgi ？ species = 42323)豐射聿似油菜油體蛋白基因啟雲力子gR雲力的花牛油體蛋白與阿樸)^ 白A-I米蘭 突變體基因或阿樸脂蛋白A-I基因融合表汰的棺物表汰載體利用重眷PCR技術將花生油體 蛋白基因和阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因或阿樸脂蛋白A-I基因構建成融合基因，優選 將花生油體蛋白基因和阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因構建成融合基因01e/apOA-IM，將 該融合基因連入PUCN得到重組質粒pUCNOA，優選連入的位點為pUCN的BamHI和^icI酶 切位點之間，雙酶切重組質粒pUCNOA，優選HindIII和Sac工雙酶切重組質粒pUCNOA，回收 2202bp的外源片段，並將該外源片段連入植物表達載體pBI 121 (植物轉基因工程中常用的 植物雙元表達載體)的HindIII和McI位點之間獲得pBINOA，即油菜油體蛋白基因啟動子 驅動的花生油體蛋白與阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體融合基因的植物表達載體或油菜油體 蛋白基因啟動子驅動的花生油體蛋白與阿樸脂蛋白A-I融合基因的植物表達載體。
最後，本發明還提供了利用以上種子特異型植物表達載體製備阿樸脂蛋白A-I米 蘭突變體或阿樸脂蛋白A-I的方法，包括如下步驟1)將上述構建表達載體導入受體植物外植體內；2)將上述受體植物材料培養為完整的植株，得到種子；3)從上述種子中分離純化得到阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體或阿樸脂蛋白A-I0其中，所述的受體植物優選為油葵，優選分離純化得到的是阿樸脂蛋白A-I米蘭 突變體。具體步驟包括1)將攜帶阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因或阿樸脂蛋白A-I基因的種子特異型植 物表達載體導入油葵恢復系外植體。將種子特異型植物表達載體導入油葵恢復系的方法可 以是本領域常規的導入方法，包括但不限於基因槍法、花粉管通道法、子房注射法和農杆 菌介導法，優選的是農桿菌介導法。農桿菌介導法中，將攜帶阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基 因或阿樸脂蛋白A-I基因的種子特異型植物表達載體導入農桿菌，由農桿菌介導轉化油葵 恢復系外植體。所述外植體包括無菌苗莖尖、子葉、子葉節、去掉一片子葉的實生株四種形 式，其中優選去掉一片子葉的實生株；2)轉基因後獲得的再生植株經抗性篩選得到抗性苗，待抗性苗生根後移栽入溫室 進行培養，直至成熟收穫種子。其中，抗性苗生根後移栽入溫室進行蛭石和營養土混合物培 養，在幼苗期進行PCR檢測和Southern blotting檢測，收穫籽粒後進行油體蛋白和阿樸脂 蛋白A-I米蘭突變體融合蛋白的Wfestern blotting檢測；3)將含阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體或阿樸脂蛋白A-I的種子在緩衝液中研磨，離 心將油體和種子的其他成分分離，洗滌油體，通過酶切反應將阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體 或阿樸脂蛋白A-I自油體表面釋放，經HPLC純化獲得阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體，並對其 進行鑑定。在本發明的載體和方法中，選擇了油菜油體蛋白基因啟動子。經實驗研究表明， 該啟動子可大大提高阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因的表達效率。優選地，在油體蛋白基 因起始密碼子周圍還可以設計Kozak序列表達控制元件，可以更加進一步提高基因表達效率。在本發明的載體和方法中，還選擇了油體蛋白和阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體或阿 樸脂蛋白A-I的融合表達。目的蛋白在轉基因植物中是以融合蛋白的形式與油體蛋白共同 在油體中特異表達，利用油體親脂疏水的特性，將轉基因植物種子粉碎，液體抽提，離心處 理，回收上層油相即可將融合蛋白與細胞內其它組分分開，可去除90%以上的種子蛋白。優 選地，在油體蛋白和阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體或阿樸脂蛋白A-I之間設計了凝血酶識別 位點，用以從油體上釋放阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體，簡化了表達產物的純化工藝，提高了 純化效率。其中，優選的油體蛋白為花生油體蛋白。花生油體蛋白和阿樸脂蛋白A-I米蘭 突變體或阿樸脂蛋白A-I的融合表達，表達效率高，效果好。在本發明公開的載體和方法中，為了提高阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因或阿樸 脂蛋白A-I基因的表達效率，根據阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因序列或阿樸脂蛋白A-I 基因序列和油葵偏愛的密碼子、GC含量對阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因或阿樸脂蛋白 A-I基因的密碼子進行了優化和全基因的人工合成。
在本發明公開的阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體或阿樸脂蛋白A-I的生產方法中，優 選的植物生物反應器為油葵。油葵作為我國一種重要的油料作物，在我國具有悠久的種植 歷史，具有其它作物不可替代的優勢。油葵產量高，作為耐旱作物，可以在鹽鹼地、乾旱地區 甚至沙漠等惡劣環境下種植，因此適於大面積推廣種植，不僅不會與糧食「爭地」，而且還 有利於提高我國山嶺薄地、乾旱貧瘠之地的利用率，緩解國家耕地緊張的壓力。因此，選擇 油葵作為生物反應器，大規模地生產阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體是適合我國國情的生產藥 用蛋白的方式。最有優勢的是，採用油葵作為生物反應器，與目前已作為阿樸脂蛋白A-I米 蘭突變體或阿樸脂蛋白A-I生產反應器的紅花相比，具有顯著的生產效率提高，產率增加 的效果。採用此發明方法生產人阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體具有以下優點1、植物表達的外源蛋白，類似於哺乳動物表達的蛋白，能進行正確的摺疊，這對於 必須具有體內活性的藥用蛋白的生產尤為重要。2、採用植物生物反應器生產的阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體更安全，因為避免了大 腸桿菌中的內毒素和動物病原菌的的汙染。3、利用轉基因植物的油體表達系統表達阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體，大大簡化了 純化工藝，降低了成本，有利於將來的產業化。較之已經被kmBioSys Genetics公司採用 的擬南芥以及紅花具有很大的優勢。4、採用本發明的種子特異型植物表達載體和製備方法，大大提高了阿樸脂蛋白 A-I米蘭突變體或阿樸脂蛋白A-I的表達量，能達到種子總蛋白含量的1. 5%。5、採用農桿菌介導法轉化植物，不僅可以降低成本、提高轉化效率，還提高了轉基 因植株的遺傳穩定性。本發明是利用轉基因技術開發高效表達的植物生物反應器，所生產阿樸脂蛋白 A-I米蘭突變體或阿樸脂蛋白A-I是治療心血管疾病和動脈粥樣硬化疾病的特效藥物。術語及解釋除有特殊說明，在本發明中出現術語均具有本領域通常的含義，其中的縮寫代表 的內容如下LDL:low density lipoproteins,低密度月旨蛋白HDL :high density lipoproteins,高密度月旨蛋白TC :total cholesterol，血漿中總膽固醇LDL-C:low density lipoproteins cholesterol，低密度月旨蛋白膽固醇apoA-I :apolipoprotein A-I 阿樸月旨蛋白 A-IapoA-IM :apolipoprotein A-I Milano 阿樸脂蛋白 A-I 米蘭突變體A-IM/A-IM 阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體二聚體pUC19 常用的大腸桿菌克隆載體，購自MBI公司pBI121 植物轉基因工程中常用的植物表達載體pUCN:攜帶油菜油體蛋白基因啟動子(NOP)的pUC19載體，插入位點為HindIII和 BamHI01eosin/apoA-IM 花生油體蛋白和阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體的融合基因pUCNOA 攜帶油菜油體蛋白基因啟動子(NOP)、花生油體蛋白和阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體融合基因的PUC19載體，插入位點為HindIII和McIpBINOA 攜帶油菜油體蛋白基因啟動子(NOP)、花生油體蛋白和阿樸脂蛋白A-I米 蘭突變體融合基因的PBI121載體，插入位點為HindIII和McI


圖1種子特異型植物表達載體pBINOA結構示意圖；圖2種子特異型植物表達載體pBINOA構建流程示意圖；圖3pUCN載體的酶切鑑定及PCR檢測；圖401eosin/apoA_IM融合基因的構建；圖5pUCN0A載體的酶切鑑定；圖6種子特異型植物表達載體pBINOA的酶切鑑定；圖7轉基因油葵nptll基因的PCR檢測；圖8轉基因油葵的阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因的PCR檢測；圖9轉基因油葵PCR-Southern雜交結果；圖10轉基因油葵籽粒油體中油體蛋白-阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體融合蛋白的 Western 檢測；圖11油葵作為生物反應器和紅花作為生物反應器製備阿樸脂蛋白A-I米蘭突變 體的比較。
具體實施例方式以下具體實施方式
僅是對於本發明進行進一步說明，並不用於限定本發明的範 圍。在了解本發明的內容後，本領域技術人員在不背離本發明精神的前提下對本發明進行 改變，這些技術方案均落在本發明的保護範圍之內。除有特殊說明外，下列實施例中所述的方法均為本領域的常規方法。實施例1 種子特異型植物表達載體本發明中首先採用PCR方法擴增了油菜油體蛋白基因啟動子(Ν0Ρ)，將該啟動子 插入pUC19的HindIII和BamHI酶切位點之間得到pUCN。同時依據阿樸脂蛋白A-I米蘭 突變體基因序列和油葵偏愛的密碼子設計並人工合成了阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因， 並將該合成的基因插入花生油體蛋白基因(Ole)的3』末端，獲得花生油體蛋白和阿樸脂蛋 白A-I米蘭突變體融合基因，同時在花生油體蛋白基因和阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因 之間添加了凝血酶酶切位點。進而將該融合基因插入PUCN的BamHI和McI酶切位點之間 得到pUCNOA，HindIII和McI雙酶切pUCNOA，瓊脂糖凝膠回收2202bp的外源片段，並將該 外源片段插入植物雙元表達載體PBI121的HindIII和McI酶切位點之間，獲得本發明提 供的植物表達載體pBINOA，pBINOA的表達盒為以油菜油體蛋白基因啟動子(NOP)驅動的 01e/apOA-IM融合基因，pBINOA結構如圖1所示，1 油菜油體蛋白基因啟動子，2 花生油體 蛋白基因，3 凝血酶酶切位點，4 阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因。將pBINOA進行測序獲 得表達盒的序列如SEQ ID NO 15所示，長度為2202bp。實施例2 種子特異型植物表達載體pBINOA的構建 植物表達載體pBINOA構建流程如圖2所示，具體步驟如下 油菜油體蛋白基因啟動子的克隆，油菜是重要的油料作物，含油量高02 45% )，而且油菜油體中20kD油體蛋白的量為MkD油體蛋白量的10倍。根據油菜油體蛋白 基因啟動子核苷酸序列(Genbank No. AF134411)設計正向引物pBINOA-1 =CCC AAG CTT TTC AACGTG GTC GGA TCA TGA CG (SEQ ID NO 1)和反向引物 pBINOA-2 CGC-GGA TCC GAATTG AGA GAG ATC GAA GAG (SEQ ID NO :2)，用於PCR擴增油菜20kD油體蛋白基因的啟動子，在 引物上分別引入了 HindIII和BamHI酶切位點(下劃線表示酶切位點)。以油菜(Brassica campestris)青油14品種基因組DNA為模板，ρΒΙΝΟΑ-l和pBINOA-2為引物，PCR的條件 為:94°C lmin、63-73°C lmin、68°C lmin，30個循環後，68°C延伸lOmin，擴增油菜油體蛋白 基因啟動子。瓊脂糖凝膠電泳並回收擴增產物，進而用HindIII和BamHI雙酶切回收所得 產物，並將其與HindIII和BamHI雙酶切的pUC19連接，將連接產物與200 μ LDH5 α感受 態細胞(購自天根生化科技(北京)有限公司)混勻，冰浴30min，42°C熱激1.5min，冰浴 3min，加入800 μ L LB培養基37°C培養45min，塗布含50 μ g/mL氨苄青黴素的LB平板，37 °C 培養過夜。PCR方法篩選轉化子，ρΒΙΝΟΑ-l和pBINOA-2為引物，PCR的條件為94°C lmin、 60-73°C lmin、72°C lmin，30個循環後，72°C延伸lOmin，將PCR產物進行瓊脂糖電泳檢測 篩選結果，將陽性轉化子命名為PUCN，將陽性轉化子進行液體震蕩培養，鹼裂解法提取質 粒，將質粒進行HindIII單酶切鑑定和Hindlll、BamHI雙酶切鑑定，瓊脂糖凝膠電泳顯示 鑑定結果如圖 3 所示，M =DNA Molecular Weight Marker λ DNA/EcoT14I, Ll =HindIII 酶切 pUCN質粒的產物為3565bp的片段，L2 =HindIII和BamHI雙酶切pUCN質粒的產物為^62bp 的載體片段和90;3bp的啟動子，L3 =PCR檢測pUCN質粒得到90!3bp的啟動子。將pUCN質粒 進行測序，測序步驟如下⑴以PUCN為模板，pUC19通用測序引物進行PCR反應，得到PCR 產物；(2)純化PCR產物，以去除酶、螢光染料、引物和其他離子；(3)純化後的PCR產物經 變性和冰浴處理後上3730測序儀(ABI公司)進行測序；(4)儀器自動分析並列印出彩色 測序圖譜和DNA序列。pUCN中外源片段長度為90!3bp，序列如SEQ ID NO :3所示，分子量 為556.7kDa。酶切結果和測序結果表明已將油菜油體蛋白基因啟動子成功克隆到pUC19 上。阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因的人工合成，依據阿樸脂蛋白A-I基因序列 (SEQ IDNO :4，NM000039)，胺基酸序列如SEQ ID NO :5所示，同時參照油葵密碼子使用頻率 (http://www. kazusa. or. jp/codon/cgi-bin/showcodon. cgi ？ species = 4232)禾口油葵基 因組中的GC含量重新設計併合成了阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因，同時第517為的鹼基 C突變為鹼基T，並在基因的5』端添加了凝血酶酶切位點，核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示 CTGGTCCCAAGGGGTAGC，胺基酸序列為SEQ ID N0:7所示L VPRG S，人工合成後的阿樸脂 蛋白A-I米蘭突變體基因750bp，分子量為462.4kDa，序列如SEQ ID N0:8所示。該基因編 碼的蛋白由249個胺基酸殘基組成，分子量為28. 585kDa。01e/apoA-IM融合蛋白基因的擴增，依據花生油體蛋白基因序列(Genbank No. AF325917)和阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因序列SEQ ID NO 8設計了兩對特異性引 物 pBIN0A-3/pBIN0A-4 和 pBIN0A-5/pBIN0A-6(序列分別如 SEQ ID NO :9，SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO :12)pBIN0A_3 和 pBINOA-6 中分別引入 BamHI 和 SacI 酶切位點 (帶下劃線的鹼基為酶切位點)，且pBINOA-3引物中在油體蛋白基因起始密碼子周圍設計 了 Kozak序列(序列中加粗部分，功能是提高轉錄和表達效率)；pBINOA-4和pBIN0A_5互 為反向互補序列。
pBINOA-3 CGC-GGA TCC AGC AAA GCC GCC ACC ATG GCT ACT GCT ACT GAT CGpBINOA-4 :GCT ACC CCT TGG GAC CAG TGA TGA TGA CCT CTT AACpBINOA-5 :GTT AAG AGG TCA TCA TCA CTG GTC CCA AGG GGT AGCpBINOA-6 :C GAG CTC TTA TTG TGT GTT AAG TTT CTT TG以pBIN0A-3/pBIN0A_4為引物，花生(品種冀花4號)基因組DNA為模板擴增終 止密碼子缺失的花生油體蛋白基因，PCR的條件為94°C lmin、50-55°C lmin、68°C lmin， 30個循環後，68 °C延伸IOmin ；以pBIN0A-5/pBIN0A-6為引物，優化後的阿樸脂蛋白A-I 米蘭突變體基因為模板擴增阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因，PCR的條件為94°C lmin、 63-73°C lmin、68°C lmin, 30個循環後，68°C延伸IOmin ；瓊脂糖凝膠電泳並回收兩種PCR擴 增產物，將兩種產物摩爾比1 1混合作為模板，以pBIN0A-3/pBIN0A-6為引物進行重疊 PCR, PCR 的條件為94°C lmin,50-55°C lmin,68°C 2min,30 個循環後，68°C延伸 IOminJlC 脂糖凝膠電泳並回收擴增產物獲得01e/apOA-IM融合基因。01e/apOA-IM融合基因的構建 如圖 4 所示，M =DNA Molecular Weight Marker DL2000, Ll :pBIN0A-3/pBIN0A_4 為引物， 花生(品種冀花4號)基因組DNA為模板擴增終止密碼子缺失的花生油體蛋白基因
的片段，L2 以pBIN0A-5/pBIN0A-6為引物，優化後的阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因為模 板擴增阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因750bp (含編碼凝血酶酶切位點的核苷酸序列)， L3 以pBIN0A-3/pBIN0A-6為引物進行重疊PCR，獲得的01e/apoA_IM融合基因。將Ole/ apoA-IM融合基因進行測序，測序結果顯示01e/apOA-IM融合基因序列如SEQ ID NO 13所 示，長1278bp，分子量787. 9kDa。預測的胺基酸殘基序列如SEQ ID NO 14所示，由425個 胺基酸殘基組成，分子量46.994kDa。0le0Sin-ap0A-IM融合基因的構建結果和測序結果表 明我們已得到0le0Sin-ap0A-IM融合基因。中間載體pUCNOA的構建，將01e/apoA_IM融合基因進行BamHI和McI雙酶切後 與同樣雙酶切的PUCN連接，將連接產物與200 μ L DH5a感受態細胞(購自天根生化科技 (北京)有限公司)混勻，冰浴30min，42°C熱激1. 5min,冰浴3min，加入800 μ L LB培養基 37°C培養45min，塗布含100 μ g/mL氨苄黴素的LB平板，37°C培養過夜。PCR方法篩選轉化 子，pBINOA-3 和 pBINOA-6 為引物，PCR 的條件為-MV lmin、60_73°C lmin、72°C 1.5min，30 個循環後，72°C延伸lOmin，將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測篩選結果，將陽性轉化子 命名為pUCNOA，將陽性轉化子進行液體震蕩培養，鹼裂解法提取質粒，將質粒進行HindIII 單酶切鑑定、HindIII和BamHI雙酶切鑑定以及BamHI和McI雙酶切鑑定，瓊脂糖凝膠 電泳顯示鑑定結果如圖 5 所示，M :DNA Molecular Weight Marker λ DNA/EcoT 141, Ll HindIII單酶切pUCNOA質粒的產物為4849bp的片段，L2 =HindIII和SacI雙酶切pUCNOA 質粒的產物為2647bp的載體片段和2202bp的外源片段(包含油菜油體蛋白基因啟動子和 oleosin-apoA-IM融合基因)L3 =BamHI和SacI雙酶切pUCNOA質粒的產物為3571bp的載 體片段和1278bp的外源片段(oleosin-apoA-IM融合基因)。將pUCNOA質粒進行測序，測 序結果SEQ ID N0:15，全長2202bp，分子量為1357. 5kDa，包括油菜油體蛋白基因啟動子和 0le0Sin-ap0A-IM融合基因。酶切結果(如圖5所示)和測序結果(如序列表中)SEQ ID N0 15表明已獲得了油菜油體蛋白基因啟動子驅動的花生油體蛋白與阿樸脂蛋白A-I米 蘭突變體融合基因的表達盒，並已將該表達盒成功克隆到載體PUC19上。
種子特異型植物表達載體pBINOA的構建，鹼裂解法提取pUCNOA質粒DNA，用 HindIII和SacI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收2202bp的外源片段，將其與經HindIII和 SacI雙酶切的pBI121連接，將連接產物與200 μ L DH5 α感受態細胞(購自天根生化科技 (北京)有限公司)混勻，冰浴30min，42°C熱激1. 5min,冰浴3min，加入800 μ L LB培養基 37°C培養45min，塗布含100 μ g/mL卡那黴素的LB平板，37°C培養過夜。PCR方法篩選轉化 子，pBINOA-1 和 pBINOA-6 為引物，PCR 的條件為-MV lmin,60-73°C Imin,72°C 2min，30 個循環後，72°C延伸lOmin，將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測篩選結果，將陽性轉化子 命名為pBINOA，將陽性轉化子進行液體震蕩培養，鹼裂解法提取質粒，將質粒進行HindIII 單酶切鑑定以及HindIII和McI雙酶切鑑定，瓊脂糖凝膠電泳顯示鑑定結果如圖6所示， M =DNA Molecularffeight Marker λ DNA/EcoT 141，Ll :HindIII 酶切 pBINOA 質粒的產物為 14205bp的片段，L2 =HindIII和SacI雙酶切pBINOA質粒的產物為12003bp的載體片段 和2202bp的外源片段(包含油菜油體蛋白基因啟動子和oleosin-apoA-lM融合基因)。 將pBINOA質粒進行測序，測序結果SEQ ID NO 15，載體的全長核苷酸序列如SEQ ID N0: 16所示。整個表達盒長2202bp，分子量為1357. 5kDa，包括油菜油體蛋白基因啟動子和 0le0Sin-ap0A-IM融合基因。油菜油體蛋白基因啟動子是種子特異型的強啟動子，在轉基因 植物的種子中驅動阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體以融合蛋白的形式與花生油體蛋白共同在 油體中特異表達，花生油體蛋白攜帶阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體錨定在油體表面。利用油 體親脂疏水的特性，將轉基因植物種子粉碎，液體抽提，離心處理，回收上層油相即可將融 合蛋白與細胞內其它組分分開，可去除90%以上的種子蛋白。並在花生油體蛋白和阿樸脂 蛋白A-I米蘭突變體之間設計了凝血酶識別位點，用以從油體上釋放阿樸脂蛋白A-I米蘭 突變體。實施例3利用該載體製備阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體3. 1上述構建的種子特異型表達載體導入受體植物外植體內；3. 1. 1農桿菌感受態細胞的製備(1)挑取根癌農桿菌LBA4404單菌落於3mL的YEB液體培養基(含鏈黴素 Sml25yg/mL)中，28°C振蕩培養過夜；(2)取過夜培養菌液500 μ L接種於50mL YEB (Sm 125 μ g/mL)液體培養基中，28 °C 振蕩培養至OD6tltl為0. 5 ；(3) 5，OOOrpm,離心 5min ；(4)加 IOmL 0. 15M NaCl 懸浮農桿菌細胞，5，OOOrpm,離心 5min ；(5) ImL預冷的20mM CaCl2懸浮細胞，冰浴，Mh內使用，或分裝成每管200 μ L，液 氮中速凍Imin，置_70°C保存備用。3. 1. 2種子特異型植物表達載體向農桿菌感受態細胞的轉化取200 μ L感受態細胞，加入Iyg構建好的質粒DNA，液氮中速凍lmin，37°C水浴 5min,然後加入ImLYEB培養基，慢速振蕩培養4h ；1, OOOrpm離心30sec，棄上清，加入 0. ImLYEB培養基重新懸浮細胞，塗布於含有100 μ g/mL Kan和125 μ g/mL Sm的YEB平板 上，28 °C培養約48h。陽性克隆的鑑定挑取平板上長出的單菌落，接種於YEB液體培養液(含有100μ g/mL Kan和125μ g/mL Sm)中振蕩培養過夜；鹼裂解法小量提取質粒DNA，以質粒DNA為模板， pBINOA-1 和 pBINOA-6 為引物，進行 PCR 擴增鑑定，PCR 的條件為94°C lmin、60_73°C lmin、 72°C 2min,30個循環後，72°C延伸lOmin，將PCR產物進行瓊脂糖電泳檢測篩選結果獲得陽
性轉化子。用於轉化油葵的農桿菌菌液的準備從平板上挑取農桿菌單菌落，接種到5mL YEB液體培養基中(含有100 μ g/mL Kan和125 μ g/mL Sm)，振蕩培養過夜，取ImL菌液接種到100_200mL YEB液體培養基(含 有100 μ g/mL Kan和125 μ g/mLSm)中，劇烈振蕩培養至0D_為0. 4 0. 8，3500rpm離心 IOmin,菌體用MS (不含植物生長調節劑和抗生素)液體培養基重懸，使0D_為0. 6左右， 以進行侵染。3. 1. 3農桿菌介導的油葵外植體的遺傳轉化將發芽3 4d的油葵種子實生幼苗的莖尖、子葉、子葉節和去掉一片子葉的實生 株四種形式的外植體，在上述農桿菌菌液中浸泡6 8min，轉至MS固體培養基上共培養 3d(25°C黑暗)。其中優選的方式是去掉一片子葉的實生株。3. 2將上述受體植物材料培養為完整的植株，得到種子並進行目的基因和蛋白的 檢測；3. 2. 1受體植物材料培養為完整的植株，得到種子將上述轉化過的外植體轉到含頭孢黴素300mg/L的MS培養基上繼續進行培養， 約7d後，轉至MS抗性篩選培養基上(含頭孢黴素300mg/L和卡那黴素70mg/L的)選擇培 養，每15 20d更換培養基，篩選三次後獲得抗性芽，將2 3釐米抗性芽轉至生根培養基 MS2 (MS+IBAO. lmg/L+Kan 70mg/L+cef 300mg/L)，待抗性苗生根後移栽入溫室進行蛭石和 營養土混合物培養，直至成熟收穫種子。3.2.2目的基因和蛋白的檢測在幼苗期對阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因進行PCR檢測，收穫籽粒後對花生油 體蛋白和阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體融合蛋白進行Western blotting檢測。轉基因油葵幼苗的PCR檢測和PCR-Southern blotting檢測採用SDS法提取抗性油葵幼苗幼嫩真葉的基因組DNA作為模板，以nptllF/nptllR 和pBIN0A-5/pBIN0A-6兩對引物進行PCR擴增檢測，引物序列分別為nptIIF =ATG AAC TGCAGG ACG AGG(SEQ ID NO :17)nptIIR :GCG ATA CCG TMAGC ACG(SEQ ID NO :18)nptIIF/ nptIIR和 pBIN0A-5/pBIN0A-6 的 PCR 擴增的條件均為為94°C lmin、60°C lmin、72°C lmin, 30個循環後，72°C延伸lOmin，分別擴增出預期為567bp的片段(部分nptll基因)和750bp 的apoA-IM基因片段，結果如圖7和圖8所示。圖7中，M:DNA Molecular WeightMarker DL2000, L1-L4 mptllF/nptnR為引物，以自卡那抗性的油葵所提基因組DNA為模板擴 增出567bp的片段，即為陽性植株，L5 非抗性油葵做對照。圖8中，M =DNA Molecular WeightMarkerDL2000, L1-L4 :pBIN0A-5/pBIN0A-6為引物，以自卡那抗性的油葵所提基因 組DNA為模板擴增出750bp的片段，即為陽性植株，L5 非抗性油葵對照。PCR-Southern blottinR 檢測1)採用SDS法提取nptll和ap0A_IM均為陽性的轉基因油葵幼苗真葉的基因組 DNA,以pBIN0A-l/pBIN0A-6為引物對基因組DNA進行PCR擴增。PCR反應條件為94°C lmin、600C lmin、72°C 2. 5min，30 個循環後，72°C延伸 IOmin02)將DNA從凝膠轉移至尼龍膜，電泳完畢，進行變性、中和後，進行半乾轉膜，將膜 晾乾，真空80°C幹烤1. 2hrs。3) DNA探針標記回收pBINOA質粒的BamH I+Sac I雙酶切片，取3 μ g DNA用於標記4)雜交63°C預雜交膜30mins，63°C雜交過夜，用充足的2XSSC，0. SDS洗膜2次；用預 熱到65°C的0. 5 X SSC, 0. 1% SDS 63°C條件下洗膜2次。5)檢測雜交和洗過的膜用衝洗緩衝液衝洗，簡單淋洗一次；在IOOmL封閉液中浸泡 30min ；在20mL抗體溶液中浸泡30min ；用IOOmL衝洗緩衝液衝洗2次，各15min ；在20mL檢 測緩衝液中平衡2-5min ；將膜的DNA面向上放到雜交袋中，加入ImL CSPD ；37°C溫浴溼潤的 膜lOmin，以使化學螢光充分反應；在X光片上室溫曝光。結果如圖9所示，M =DNA Molecular WeightMarker λ DNA/EcoT 141，L1-L4 以 PCR 檢測陽性植株基因組為模板以 pBINOA-1/ pBINOA-6為引物擴增產物的Southern blotting結果，2. 2kb處顯示雜交信號，與預期結果 一致，表明oleosin-apoA-lM融合基因已經整合到油葵基因組中，L5 非轉基因油葵對照。轉某籽粒Φ花牛油體蛋白禾口阿樸脂^SA-I米S突奪體融合蛋白的 Westernblotting 檢泖丨將轉基因油葵籽粒於5V研磨緩衝液(50mM Tris-HCl pH 7. 5,0. 4M sucrose, 0.5M NaCl)中研磨，離心IOXg 30min，分為三部分，取油相，重新懸浮於等體積的研磨緩 衝液中，混勻，輕輕加入5V預冷的50mM Tris-HCl pH 7. 5緩衝液，離心10 X g 30min，取油 相。將上述過程重複2次，用以進一步去除剩餘的水溶性成分和不溶性成分，得到純淨的油 體(油體的成分包括中性脂類磷脂、油體蛋白)。在油體中加入2V乙醚，離心，中性脂類 留在了上層乙醚相中，磷脂在下層的水相中，取中間的蛋白層，以0. IM的蔗糖緩衝液重懸， 加入氯仿甲醇O 1)混合物，抽提兩次，取中間蛋白層，乙醚抽提一次，溶於無菌水中。進 行SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳，經轉膜後用山羊抗兔阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體的多克隆抗 體進行Wfestern blotting分析，結果如圖10所示，M 蛋白分子量標準，Ll和L2 為自轉基 因油葵的種子中提取的油體蛋白，有阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體的表達，表達產物大小約 為48kDa，與預期的大小一致(花生油體蛋白18. 4kDa+凝血酶酶切位點0. 6kDa+阿樸脂蛋 白A-I米蘭突變體28. 9kDa)。表達量佔種子總蛋白的1. 1 %，超過了重組藥物蛋白在植物 中表達的最低商業化要求(1% )，因此利用植物油體表達系統來實現阿樸脂蛋白A-I米蘭 突變體的產業化，具有可行性和廣闊的應用前景。3. 3從上述種子中分離純化獲得阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體。第一步將油體與種子中的其它成分分開將種仁於5V研磨緩衝液(50mMTris-HCl pH 7. 5，0. 4M蔗糖，0. 5M NaCl)中研磨， 離心(10Xg)30min，分為三部分最底部是不可溶沉澱(籽殼、纖維質材料、不溶糖、蛋白質 和其它不溶性汙物)，中間是水相，內含可溶的細胞成分(儲藏蛋白)，最上層是油體和與之 結合的油體蛋白。第二步洗滌油體
取第一步所得油相，重新懸浮於等體積的研磨緩衝液中，混勻，加入5V預冷的 50mMTri s-HCl pH 7. 5緩衝液，離心(10 X g) 30min，取油相。將上述過程重複2次，用以 進一步去除剩餘的水溶性成分和不溶性成分，洗滌過的油體重懸於等體積預冷的50mM Tris-HCl pH7. 5中，這樣所得的油體是基本純淨的油體製品，僅存的蛋白質是油體蛋白。第三步酶切反應釋放阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體蛋白用凝血酶酶切緩衝液(20mM Tris-HCl ρΗ8· 4、150m M NaCl、2. 5m M CaCl2)洗滌 油體兩次，加入適量的凝血酶，37°C過夜，離心，阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體蛋白存在於水 相中。第四步HPLC純化阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體蛋白上反相色譜柱C4(5y，0. 24*25cm)，紫外波長214nm，緩衝液々(10%乙腈0. 1%H 氟乙酸)2mL/min平衡柱子，將上一步所得水相上樣，對柱子施以0_60 %緩衝液B (95 %乙腈 0. 三氟乙酸)線性梯度洗脫，得到純的阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體蛋白，純度達99. 5% 以上。^mm 4 M^^m^m.mm^m^^m^m.^m^mmm^ a-I 米 蘭突變體的比較取相同質量QSOmg)的轉阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因的油葵種子和紅花種 子，依據實施例3分離純化獲得阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體蛋白，上樣量為所得總量的十分 之一，進行Western blotting檢測，結果如圖11所示，M 蛋白分子量標準，Ll 自轉基因紅 花純化的阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體，大小為28. 9kDa，與預期大小一致，定量為50ng，L2 白轉基因油葵純化的阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體，大小為28. 9kDa，與預期大小一致，定量 為80ng。由此推算Ikg轉基因油葵種子可獲得2. 85g阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體，同等條 件下Ikg轉基因紅花種子可獲得1. 78g阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體。而且油葵的畝產量約 250kg.紅花的畝產量約200公斤，無論是從種子阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體產率還是單位 面積種植作物的阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體產量來看，油葵都要優先於紅花。
1權利要求
1.一種表達載體，含有阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體或阿樸脂蛋白A-I與花生油體蛋白 融合基因，其中啟動子為油菜油體蛋白基因啟動子。
2.根據權利要求1的載體，其具有SEQID N0:15所示序列。
3.一種構建權利要求1所述的表達載體的方法，其包括如下步驟1)分離克隆油菜油體蛋白基因啟動子和花生油體蛋白基因。2)按照植物偏愛的密碼子設計合成阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體或阿樸脂蛋白A-I基 因，其特徵是按照油葵偏愛的密碼子優化阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因。3)構建以油菜油體蛋白基因啟動子驅動的花生油體蛋白與阿樸脂蛋白A-I米蘭突變 體或阿樸脂蛋白A-I融合基因植物表達載體。
4.根據權利要求3的方法，包括如下步驟1)分離克隆油菜油體蛋白基因啟動子和花生油體蛋白基因。2)按照植物偏愛的密碼子設計合成阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因，其特徵是按照油 葵偏愛的密碼子優化阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因。3)構建以油菜油體蛋白基因啟動子驅動的花生油體蛋白與阿樸脂蛋白A-I米蘭突變 體融合基因植物表達載體。
5.根據權利要求4的方法，其中的油菜油體蛋白啟動子可以克隆到pUC19的HindIII 和BamHI位點之間。
6.根據權利要求5的方法，在步驟( 中將頻率小於10%的密碼子一律認為是稀有密 碼子被排除，其餘的各密碼子按油葵密碼子使用頻率優化。
7.根據權利要求6的方法，優化前後的一致性大於60%。
8.根據權利要求7的方法，優化前後的一致性為72%。
9.根據權利要求8的方法，在步驟(3)中利用重疊PCR技術將花生油體蛋白基因和阿 樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因基因構建成融合基因01e/apOA-IM，將該融合基因連入pUCN 得到重組質粒pUCNOA，優選連入的位點為pUCN的BamHI和McI酶切位點之間，雙酶切重組 質粒pUCNOA，優選HindIII和&icl雙酶切重組質粒pUCNOA，回收2202bp的外源片段，並將 該外源片段連入植物表達載體的HindIII和McI位點之間。
10.一種製備阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體或阿樸脂蛋白A-I的方法，其包括如下步驟1)將權利要求1或2所述表達載體導入受體植物外植體內；2)將上述受體植物材料培養為完整的植株，得到種子；3)從上述種子中分離純化得到阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體或阿樸脂蛋白A-I0
11.根據權利要求10所述的方法，其中受體植物為油葵。
12.根據權利要求10所述的方法，所製備的是阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體。
13.根據權利要求10所述方法，其中步驟1)中的導入方法為農桿菌介導法轉化。
14.根據權利要求11所述方法，其中所述油葵種子為卡那黴素抗性表型。
15.根據權利要求10所述方法，其中所述純化方法為高效液相色譜法。
16.根據權利要求10所述方法，其中的分離純化方法包括將含阿樸脂蛋白A-I米蘭突 變體或阿樸脂蛋白A-I的種子在緩衝液中研磨，離心將油體和種子的其他成分分離，洗滌 油體，通過酶切反應將阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體或阿樸脂蛋白A-I自油體表面釋放，經 HPLC純化獲得阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體。
全文摘要
本發明公開了一種種子特異型表達載體及其構建方法與應用，主要是在植物雙元表達載體pBI121的限制性內切酶酶切位點HindIII和SacI的之間插入以油菜油體蛋白基因啟動子驅動的花生油體蛋白基因-阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體基因組成的融合蛋白表達盒，得到發明中所述的植物表達載體pBINOA。另外，提供了一種利用該表達載體轉化油葵構建植物生物反應器製備阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體的方法，該方法不僅可以提高阿樸脂蛋白A-I米蘭突變體的產率，而且大大降低生產成本，適合工業化生產。
文檔編號C12N15/82GK102127562SQ20101058001
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月9日 優先權日2009年12月9日
發明者於成鋼, 劉培, 盧海剛, 安勝軍, 李雪, 柴錫慶, 溫昕, 焦展, 王崑聲, 胡良元, 許海民, 邵鐵梅, 陳雲雨 申請人:安勝軍, 柴錫慶, 王崑聲