一種毛細管電泳塗層柱的製作方法

2023-07-31 15:16:11 1

專利名稱：一種毛細管電泳塗層柱的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種毛細管電泳柱，特別涉及一種採用新型聚合物塗層的毛細管電泳塗層柱。
背景技術：
毛細管內表面由於Si-OH的電離，形成Si-O-，存在對鹼性物質的吸附，吸附容易造成譜圖拖尾，分離柱效下降，分離時間增長等缺陷。因此控制電滲流，降低吸附是提高鹼性物質分離效果的一個非常有效的手段。利用電壓減小的方法，可以降低電滲流，但是也降低了電泳的速度，鹼性物質之間的淌度減小，增大了分離時間。利用極限pH值可以減緩吸附，控制電滲流，但是像鹼性蛋白質、核苷等生物分子，在過高、過低pH值下均易發生水解，變性使分離失去意義。相比之下，毛細管塗層技術用於改變毛細管內壁的表面電荷是控制電滲流，減小吸附的有效途徑。
傳統的塗層材料多採用傳統聚合物，而傳統聚合物一般為線性聚合物，線性聚合物的粘度往往隨著濃度的增加而增加，對毛細管進行塗敷時，塗敷濃度增大，會造成粘度急劇增加，很容易造成塗敷不均，甚至堵塞毛細管。而濃度太小的話，又很容易造成塗層太薄，不能完全將毛細管壁上的Si-OH覆蓋；所以線性聚合物的塗敷濃度一般在5％左右，不能很好的覆蓋矽羥基，抑制鹼性物質的吸附。
樹狀支化大分子有著規整的樹冠結構，空間結構呈現球形(如附錄一)。很大程度上避免了傳統聚合物的鏈與鏈之間交聯，宏觀上呈現出粘度較小，隨著濃度的增加粘度變化很小的特點，比較適合塗敷毛細管；由於樹狀支化大分子樹冠部分存在大量的官能團，比較容易跟毛細管壁的Si-OH結合，塗敷簡單，塗層牢固。

發明內容為了克服以上技術的不足，本發明利用提供一種採用新型聚合物塗層的毛細管電泳塗層柱，克服了傳統的塗層材料——線性聚合物塗敷濃度太低，塗層厚度不夠，不能很好抑制矽羥基的電離的缺點。
本發明是通過以下措施來實現的本發明的毛細管電泳塗層柱，是由樹狀支化大分子經過物理吸附和化學鍵合的方式製得毛細管電泳塗層柱，所述的樹狀支化大分子為超支化聚合物或樹枝狀大分子。
本發明的毛細管電泳塗層柱，所述的超支化聚合物為超支化聚(胺-酯)或超支化聚酯。所述的物理吸附方式為直接將超支化聚(胺-酯)、超支化聚酯塗敷在毛細管內壁；所述的化學鍵合方式為利用矽烷化偶聯劑γ-縮水甘油氧丙基三甲氧基矽烷將合成的超支化聚(胺-酯)或超支化聚酯塗於毛細管內壁。
本發明的毛細管電泳塗層柱，所述的樹枝狀大分子為有機矽樹枝狀大分子。所述的物理吸附方式為直接將有機矽樹枝狀大分子塗敷到毛細管電泳柱內壁；所述的化學鍵合方式為利用矽烷化偶聯劑γ-氨基丙基三乙氧基矽烷(KH-550)、雙[γ-(三乙氧基矽基)丙基]胺(KH-402)將合成的矽氯鍵封端的有機矽樹枝狀大分子塗於毛細管內壁。或以乙烯基三乙氧基矽烷(Vinyl tirethoxysilane，A-151)為偶聯劑將合成的以雙鍵封端的有機矽樹枝狀大分子塗於毛細管內壁。
1.本發明的塗層柱的原理根據樹狀支化大分子一個最突出的特點就是在同等的條件下，其比傳統的聚合物的粘度低。因此如果將樹狀支化大分子作為毛細管柱塗層材料，就解決了傳統聚合物高濃度必然伴隨著高粘度的問題。由於其粘度較低，因而很容易的塗敷於毛細管柱內壁，形成穩定的薄層，而且更為重要的是，樹狀支化大分子分子外圍有大量可供改性的活性端基，因而更易於鍵合於毛細管柱內表面，提高聚合物塗層的穩定性，這就為能夠更好的抑制電滲流和減少對蛋白質、鹼基等鹼性物質的吸附，改善對鹼性物質的分析分離效果提供了結構上的保障。
樹狀支化大分子同傳統線性聚合物比較如表1。
表1
樹狀支化大分子由於具有高度支化三維立體球狀結構以及大量的表面官能團，因此顯示出與線性分子截然不同的性質，如低粘度、無鏈纏繞和良好的溶解性。本發明的樹狀支化大分子塗層毛細管電泳柱在工業、農業、國防、醫學、生命科學、環境保護等國民經濟領域具有重要的應用前景，對人類社會的進步將產生一定的影響。
2.本發明的毛細管電泳塗層的製備2.1 物理吸附毛細電泳塗層柱2.1.1 Si-Cl封端有機矽樹枝狀大分子的物理吸附毛細管電泳塗層柱將已經製得的各代以Si-Cl封端有機矽樹枝狀大分子分別溶於除水淨化的二氯甲烷中，配置成15％的溶液，以1～2Mpa的氮氣壓將溶液壓入毛細管柱內，在0.5MPa的氮氣流下將塗漬液緩慢吹出，使塗漬液在毛細管內壁上形成一層均勻的液膜。
塗層柱的老化處理將用有機矽樹枝狀大分子塗漬過的毛細管柱置於氣相色譜爐內於1Mpa的氮氣流下從50℃半小時程序升溫至200℃，保持終點溫度3h，冷卻後用無水二氯甲烷衝洗掉未反應的樹枝狀大分子，然後無水甲醇衝洗柱子半小時，反應掉剩餘的Si-Cl，即得物理吸附型塗層毛細管柱。反應方程式如下 2.1.2雙鍵封端的有機矽樹枝狀大分子的物理吸附毛細管電泳塗層柱將製得得各代以雙鍵封端的有機矽樹枝狀大分子配置成20％得二氯甲烷溶液，以1～2Mpa的氮氣壓將溶液壓入毛細管柱內，在0.5MPa的氮氣流下將塗漬液緩慢吹出，使塗漬液在毛細管內壁上形成一層均勻的液膜即得雙鍵封端的有機矽樹枝狀大分子的物理吸附毛細管電泳塗層柱2.1.3超支化聚(胺-酯)的物理吸附毛細管電泳塗層柱將超支化聚(胺-酯)配置成10％的甲醇溶液用於塗敷毛細管電泳柱，詳細步驟同2.1.12.1.4超支化聚酯的物理吸附毛細管塗層柱詳細步驟同2.1.32.2化學鍵合毛細管電泳塗層柱
2.2.1 Si-Cl封端有機矽樹枝狀大分子的化學鍵合毛細管電泳柱塗層柱毛細管柱的預處理在一定的氮氣壓力下，先用氫氟酸侵蝕毛細管柱內壁約5min，接著用二次蒸餾水和甲醇順序地清洗用氫氟酸預處理過的毛細管柱各10min，最後用氮氣將毛細管柱吹乾。
毛細管柱的矽烷化處理將偶聯劑KH-550壓入經預處理過的毛細管柱內，並用氮氣緩緩吹出剩餘的塗漬液，然後將毛細管柱置於氣相色譜爐內於一定的氮氣流下從50℃半小時程序升溫至150℃，保持終點溫度3h進行老化處理，以使塗層固化。該反應為偶聯劑γ-氨基丙基三乙氧基矽烷上的乙氧基與毛細管壁上的Si-OH反應，將活性端基胺基引入毛細管內壁上，具體反應方程式如下 有機矽樹枝狀大分子化學鍵合塗層柱的製備將已經各代以Si-Cl封端有機矽樹枝狀大分子分別溶於除水淨化的二氯甲烷中，配置成15％的溶液，以1～2Mpa的氮氣壓將溶液壓入毛細管柱內，在0.5MPa的氮氣流下將塗漬液緩慢吹出，使塗漬液在毛細管內壁上形成一層均勻的液膜，然後將塗層毛細管柱置於氣相色譜爐內於一定的氮氣流下從50℃半小時程序升溫至200℃，保持終點溫度3h進行老化處理，以使有機矽有機矽樹枝狀大分子表面的端Si-Cl與矽烷化處理過毛細管壁上的-NH2反應，從而將有機矽有機矽樹枝狀大分子鍵合於毛細管內壁上。反應方程式如下 最後利用二氯甲烷衝洗掉未反應的樹枝狀大分子，用甲醇衝柱半小時來反應掉未鍵合的Si-Cl，用氮氣吹乾即得以KH-550為偶聯劑的熱交聯化學鍵合塗層柱。
2.2.2雙鍵封端的有機矽樹枝狀大分子的化學鍵合毛細管電泳塗層柱毛細管預處理同2.2.1。
雙鍵封端的有機矽樹枝狀大分子的化學鍵合毛細管電泳塗層柱的製備將各代以雙鍵封端的樹枝狀大分子、乙烯基三乙氧基矽烷和偶氮二異丁氰以質量比10∶20∶1的比例混合後，溶於二氯甲烷溶劑中，製得樹枝狀大分子含量為15％的混合溶液。將混合溶液在2MPa氣壓下，將混合溶液充入毛細管柱中，保持5分鐘後用氮氣吹乾，從40℃開始半小時程序升溫至120℃，使乙烯基三乙氧基矽烷與雙鍵封端的樹枝狀大分子的聚合和鍵合同時進行。在終點保持溫度1h，用二氯甲烷衝洗掉未反應的G3和乙烯基三乙氧基矽烷，用氮氣吹乾即得雙鍵封端的有機矽樹枝狀大分子的化學鍵合塗層柱。
反應方程式如下 2.2.3超支化聚(胺-酯)的化學鍵合毛細管電泳塗層柱毛細管預處理同2.2.1。
毛細管柱的矽烷化處理將偶聯劑γ-縮水甘油氧丙基三甲氧基矽烷吸入經預處理過的毛細管柱內，並用氮氣緩緩吹出剩餘的塗漬液，然後將毛細管柱置於氣相色譜爐內於一定的氮氣流下從50℃至150℃程序升溫，保持終點溫度3h進行老化處理，以使塗層固化。該反應為偶聯劑γ-縮水甘油氧丙基三甲氧基矽烷上的甲氧基與毛細管壁上的矽羥基反應，將活性端基環氧基引入毛細管內壁上，具體反應方程式如下
超支化聚(胺-酯)化學鍵合塗層柱的製備將合成的分別以三羥甲基丙烷和季戊四醇為核的超支化聚(胺-酯)的第五代、第六代、第七代產物吸入經矽烷化處理的毛細管柱內，在一定的氮氣流下將剩餘的塗漬液緩慢吹出，然後將化學鍵合塗層毛細管柱置於氣相色譜爐內於一定的氮氣流下從50℃至150℃程序升溫，保持終點溫度3h進行老化處理，以使超支化聚(胺-酯)的端羥基與毛細管壁上的環氧基反應，從而將超支化聚(胺-酯)鍵合於毛細管內壁上其具體反應如下 2.2.4超支化聚酯的化學鍵合毛細管電泳塗層柱同2.2.33.本發明毛細管電泳塗層柱的性能測試所製得的樹狀支化大分子毛細管電泳塗層柱，塗層性能良好，在pH＝5時，對鹼性蛋白質的分離柱效普遍達到106，有效的抑制了矽羥基的電離對鹼性蛋白質的吸附。適用鹼性蛋白質等生物大分子的毛細管電泳分離所製得的有機矽樹枝狀大分子毛細管電泳塗層柱，塗層性能良好，在pH＝4.5時，對鹼基及其衍生物的分離柱效普遍達到1.2×105，分離效果良好，有效的抑制了矽羥基的電離對鹼基及其衍生物的吸附。適用於有機鹼性小分子和無機陽離子的分離。
本發明的有益效果是，具有塗層性能好，對鹼性蛋白質、有機鹼性小分子、無機陽離子等的分離效果好，有效抑制了對鹼基及其衍生物的吸附。
(四)附錄說明

圖1.為本發明的樹狀支化大分子聚合物的兩種平面結構2.為本發明的毛細管電泳塗層柱的分離譜圖。
圖中，a，g的電泳條件pH＝5.0的磷酸鹽緩衝溶液，分離電壓15.8KV；內徑75μm電泳柱，51cm×35.5cm；賓達1229毛細管電泳儀，UV-214檢測；1.細胞色素C、2.溶菌酶、3.α胰凝乳蛋白酶原A。
h的電泳條件pH＝5.0的磷酸鹽緩衝溶液，分離電壓16KV；內徑75μm電泳柱，55cm×50cm；賓達1229毛細管電泳儀，UV-214檢測；1.細胞色素C、2.溶菌酶、3.α胰凝乳蛋白酶原A。
b，c，d，e，f的電泳條件pH＝4.5的磷酸鹽緩衝溶液，分離電壓16KV；內徑75μm電泳柱，55cm×50cm；賓達1229毛細管電泳儀，UV-254檢測；1.腺嘌呤、2.腺苷和3.6-糠氨基嘌呤。
具體實施方式
實例一空白柱pH＝5時對細胞色素C、溶菌酶、α胰凝乳蛋白酶原A三種鹼性蛋白質的分離譜圖如圖2a，無法分離；pH＝4.5時對腺嘌呤、腺苷和6-糠氨基嘌呤三種鹼基及其衍生物如圖2b，分離效果不好，柱效普遍為1.8×104，分離時間過長，近50分鐘方能分離完全。
實例二以四氯矽烷為中心起始核，以烯丙基溴化鎂、甲基氫二氯矽烷為增長單體，反覆進行Grignard反應和矽氫加成反應三次得3代以矽氯鍵封端的有機矽樹枝狀大分子。
3代以矽氯鍵封端的有機矽樹枝狀大分子物理吸附塗層柱如2.1.1所述製得塗層毛細管電泳柱，測試其柱性能。得到譜圖如圖2c，分離柱效平均達到9×104，20分鐘內即可將腺嘌呤、腺苷和6-糠氨基嘌呤三種鹼基及其衍生物分離完全。
實例三以四甲基四乙烯基環四矽氧烷為中心起始核，以甲基氫二氯矽烷，烯丙基溴化鎂為增長單體，反覆進行矽氫加成，Grignard反應3.5次得3.5代以矽氯鍵封端的有機矽樹枝狀大分子3.5代以矽氯鍵封端的有機矽樹枝狀大分子化學鍵合塗層柱(KH-550為偶聯劑)如2.2.1所述製得塗層毛細管電泳柱，測試其柱性能。得到譜圖如圖2d，分離柱效平均達到12×104，18分鐘內即可將三種物質分離完全。
實例四如實例三製得3.5代以矽氯鍵封端的有機矽樹枝狀大分子。
3.5代以矽氯鍵封端的有機矽樹枝狀大分子化學鍵合塗層柱(KH-402為偶聯劑)如2.2.1所述以KH-402為偶聯劑製得塗層毛細管電泳柱。反應方程如下 得到譜圖如圖2e，分離柱效平均達到5×104，23分鐘內即可將三種物質分離完全。
實例五如實例三反覆進行反應三次得3代以雙鍵封端的有機矽樹枝狀大分子。
3代以雙鍵封端的有機矽樹枝狀大分子化學鍵合塗層柱(A-151為偶聯劑)如2.2.2製得化學鍵合塗層柱，測定其柱性能得到譜圖如圖2f，分離柱效平均達到10×104，17分鐘內即可將三種物質分離完全。
實例6其中1為對甲苯磺酸。
一步法合成三羥甲基丙烷7代為核的超支化聚(胺-酯)在95.5g N，N-二羥乙基-3-胺基丙酸甲酯單體中，加入505.9mg對甲苯磺酸和723.0mg三羥甲基丙烷，升溫至回流溫度保持不變，反應4小時，再抽真空除去反應中生成的甲醇和未反應的小分子化合物，即得超支化聚(胺-酯)第五代產物(G5)。改變單體的比例，在同樣條件下聚合，分別得到超支化聚(胺-酯)第六代(G6)和第七代(G7)產物以三羥甲基丙烷7代為核的超支化聚(胺-酯)的化學塗層毛細管電泳柱同2.2.3製得化學塗層毛細管電泳柱。
將製得的毛細管電泳柱用於分離細胞色素C、溶菌酶、α胰凝乳蛋白酶原A三種鹼性蛋白質，得到如圖2g的譜圖，分離柱效達到73×104。分離效果良好，完全抑制了鹼性蛋白質的吸附。
實例7準一步法合成超支化聚酯在四頸瓶中加入2.0g三羥甲基丙烷、30mg對甲苯磺酸和6.0g 2，2-二羥甲基丙酸，升溫至140℃保持不變，反應2小時，在此溫度下真空抽濾1小時即得超支化聚酯的第一代產物(G1)；在此反應體系內加入12.0g 2，2-二羥甲基丙酸和60mg對甲苯磺酸，在同樣的反應條件下進行反應，即得超支化聚酯的第二代產物(G2)；依次按不同比例加入2，2-二羥甲基丙酸和對甲苯磺酸，在同樣條件下進行反應，分別得到以三羥甲基丙烷為核的超支化聚酯的第三代產物(G3)、第四代產物(G4)、第五代產物(G5)和第六代產物(G6)。
準一步法合成的以三羥甲基丙烷5代為核的超支化聚酯的化學塗層毛細管電泳柱按照2.1.4所示製得物理吸附塗層柱，用於分離細胞色素C、溶菌酶、α胰凝乳蛋白酶原A三種鹼性蛋白質。測得其柱性能，得到如圖2.h的譜圖，分離柱效平均為3×104。
權利要求
1.一種毛細管電泳塗層柱，其特徵在於由樹狀支化大分子經過物理吸附或化學鍵合的方式粘合在電泳毛細管的內壁製成，所述的樹狀支化大分子為超支化聚合物或樹枝狀大分子。
2.根據權利要求1所述的毛細管電泳塗層柱，其特徵在於所述的超支化聚合物為超支化聚(胺-酯)或超支化聚酯。
3.根據權利要求1所述的毛細管電泳塗層柱，其特徵在於所述的樹枝狀大分子為有機矽樹枝狀大分子。
4.根據權利要求2所述的毛細管電泳塗層柱，其特徵在於所述的化學鍵合方式的偶聯劑為γ-縮水甘油氧丙基三甲氧基矽烷。
5.根據權利要求3所述的毛細管電泳塗層柱，其特徵在於所述的化學鍵合方式的偶聯劑為γ-氨基丙基三乙氧基矽烷或雙[γ-(三乙氧基矽基)丙基]胺，所述的有機矽樹枝狀大分子為矽氯鍵封端的有機矽樹枝狀大分子。
6.根據權利要求3所述的毛細管電泳塗層柱，其特徵在於所述的化學鍵合方式的偶聯劑為乙烯基三乙氧基矽烷，所述的有機矽樹枝狀大分子為雙鍵封端的有機矽樹枝狀大分子。
全文摘要
本發明涉及一種毛細管電泳柱，特別涉及一種採用新型聚合物塗層的毛細管電泳塗層柱，用對鹼性蛋白質、有機鹼性小分子、無機陽離子等的電泳分離。本發明的毛細管電泳塗層柱，是由樹狀支化大分子經過物理吸附和化學鍵合的方式製得毛細管電泳塗層柱，所述的樹狀支化大分子為超支化聚合物或樹枝狀大分子。本發明的有益效果是，具有塗層性能好，對鹼性蛋白質、有機鹼性小分子、無機陽離子等的分離效果好，有效抑制了對鹼基及其衍生物的吸附。
文檔編號G01N27/447GK1885026SQ200610044550
公開日2006年12月27日 申請日期2006年5月29日 優先權日2006年5月29日
發明者壽崇琦, 邢希學, 康傑分, 張志良, 宋南京, 尚盼 申請人:濟南大學