一種用於鑑定中藥黃芪的引物對及其應用的製作方法

2023-07-10 10:14:01

本發明屬於分子生物學領域，涉及一種採用分子生物學手段鑑定中藥的方法，具體為一種用於鑑定中藥黃芪的引物對及其應用。
背景技術：
：卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤，死亡率位居婦科疾病榜首。其發生、發展是多基因改變的過程，是多種癌基因和抑癌基因表達失衡導致腫瘤細胞無控增殖及凋亡抑制的結果，卵巢癌早期常無特徵性症狀和體徵，難以發現。目前西醫卵巢癌治療以手術配合放化療為主，隨著中醫藥配合西醫治療腫瘤新模式的日趨完善，對改善症狀、提高療效，甚至延長生命都有著積極的作用，近年來許多學者致力於卵巢癌中醫藥方向的實驗研究，表明半支蓮含藥血清和熊果酸對人卵巢癌skov3細胞的增殖有抑制作用。針對目前中藥治療卵巢癌單體配伍方向的研究較少，基於補氣活血的中醫理論基礎，現有技術中對黃芪甲苷配伍薑黃素治療發生轉移的卵巢癌進行療效觀察。採用免疫組化及實時螢光定量pcr檢測多種腫瘤因子蛋白和基因的表達。探討黃芪甲苷配伍薑黃素對發生轉移的卵巢癌腫瘤生長的抑制作用，為臨床用藥和新藥研發提供實驗依據。黃芪是我國常用大眾藥材之一，2010版藥典收錄記載，為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的乾燥根，具有補氣昇陽，固表止汗，利水消腫，生津養血，行滯通痺，脫毒排膿，斂瘡生肌的功效。現代藥理研究表明，中藥黃芪對免疫系統的調節，抗氧化、抗腫瘤、抗輻射、抗菌、抗病毒、保肝、利尿等都有很好的作用。黃芪屬品種繁多，資源分布廣泛，且2010版藥典收錄的中藥黃芪來源蒙古黃芪和膜莢黃芪為國家三級保護植物，屬漸危種，雖然近幾年中藥種植面積逐漸增加，仍有供不應求的狀況發生。市場上關於黃芪的偽品，主要有華黃芪、土黃芪、紫花苜蓿、斜莖黃芪等，部分偽品含有生物鹼等，誤服後果嚴重。中藥黃芪及其混偽品的鑑別對植物資源保護及藥用植物安全合理利用都具有重要的意義。隨著分子生物學的發展，分子鑑定方法也越來越多的應用到中藥材的鑑別上。條形碼技術作為一種熱門、前沿的分子鑑定技術，在中藥材鑑定中得到廣泛的應用。技術實現要素：本發明的目的是：為了克服現有技術的缺陷，獲得一種採用分子生物學手段，快速、準確鑑定黃芪的方法，本發明提供了一種用於鑑定中藥黃芪的引物對及其應用。技術方案：一種用於鑑定中藥黃芪的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。優選的，所述引物對p1、p2和p3的上遊引物的5，端加上特異性的gc發卡結構，所述發卡結構的長度為40bp，序列為seqidno.7。表1引物對及發卡結構序列名稱序列(5，-3，)seqidno.p1-fgctcctccgcttattgatatgc1p1-rggaagtaaaagtcgtaacaaggat2p2-faagggcattcaggagctctag3p2-rgtttacgtggcctgtttcaag4p3-fggcccgtaacactgtctggtaa5p3-rgcgcgtcgtgaagcgtgaattc6發卡結構cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggg7所述引物對在製備鑑定中藥黃芪試劑盒中的應用。優選的，所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應緩衝液。優選的，所述試劑盒鑑定中藥黃芪的步驟包括：(1)提取黃芪樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋50～500倍後作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋10～100倍後作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產物，並採用瓊脂糖凝膠電泳檢測。進一步的，所述黃芪樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。進一步的，所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。有益效果：(1)本發明所述用於鑑定中藥黃芪的引物對經發卡結構修飾後能夠特異性的識別藥用黃芪；(2)本發明所述引物對用於鑑定中藥黃芪的試劑盒中能夠快速、準確的鑑定是否為藥用黃芪。附圖說明圖1是實施例1～3pcr鑑定結果電泳圖；其中m為分子量為2000的maker；1為實施例1pcr產物鑑定結果；2為實施例2pcr產物鑑定結果；3為實施例3pcr產物鑑定結果。具體實施方式實施例1一種用於鑑定中藥黃芪的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物對p1、p2和p3的上遊引物的5，端加上特異性的gc發卡結構，所述發卡結構的長度為40bp，序列為seqidno.7。所述引物對在製備鑑定中藥黃芪試劑盒中的應用。所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應緩衝液。所述試劑盒鑑定中藥黃芪的步驟包括：(1)提取黃芪樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋50倍後作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋100倍後作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產物，並採用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述黃芪樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。實施例2一種用於鑑定中藥黃芪的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物對p1、p2和p3的上遊引物的5，端加上特異性的gc發卡結構，所述發卡結構的長度為40bp，序列為seqidno.7。所述引物對在製備鑑定中藥黃芪試劑盒中的應用。所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應緩衝液。所述試劑盒鑑定中藥黃芪的步驟包括：(1)提取黃芪樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋200倍後作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋20倍後作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產物，並採用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述黃芪樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。實施例3一種用於鑑定中藥黃芪的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物對p1、p2和p3的上遊引物的5，端加上特異性的gc發卡結構，所述發卡結構的長度為40bp，序列為seqidno.7。所述引物對在製備鑑定中藥黃芪試劑盒中的應用。所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應緩衝液。所述試劑盒鑑定中藥黃芪的步驟包括：(1)提取黃芪樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋500倍後作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋10倍後作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產物，並採用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述黃芪樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。如圖1所示，將實施例1～3的擴增產物進行電泳檢測，條帶清晰可見，產物單一。sequencelisting蘇州市李良濟健康產業有限公司一種用於鑑定中藥黃芪的引物對及其應用7patentinversion3.3122dna人工序列1gctcctccgcttattgatatgc22224dna人工序列2ggaagtaaaagtcgtaacaaggat24321dna人工序列3aagggcattcaggagctctag21421dna人工序列4gtttacgtggcctgtttcaag21522dna人工序列5ggcccgtaacactgtctggtaa22622dna人工序列6gcgcgtcgtgaagcgtgaattc22740dna人工序列7cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggg40當前第1頁12