一種抗傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒和疫苗及其製備方法

2023-07-10 00:58:56 1

一種抗傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒和疫苗及其製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種抗傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒和疫苗及其製備方法，所述抗傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒由同時表達的流感病毒基質蛋白M1和融合蛋白HA-24構成；所述融合蛋白HA-24由流感病毒HA蛋白與魚類傳染性脾腎壞死病毒ORF24構建而成，所述融合蛋白HA-24的核酸序列如SEQ?ID?NO:3、5、7、9或11所示。所述抗傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒的製備方法，包括以下步驟：製備融合基因HA-24；製備重組杆狀病毒穿梭載體rBacmid；製備重組昆蟲杆狀病毒；獲得同時表達流感病毒基質蛋白M1和融合蛋白HA-24的病毒樣顆粒。所述疫苗包含上述任一項所述的病毒樣顆粒。本發明混合病毒樣顆粒疫苗能引起機體免疫系統產生強型應答，免疫力強，持續時間長，能預防魚類傳染性脾腎壞死病毒病，而且非常安全。
【專利說明】一種抗傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒和疫苗及其製備 方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及病毒樣顆粒領域，尤其涉及一種抗傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒 和疫苗及其製備方法。

【背景技術】
[0002] 傳染性脾腎壞死病毒（Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus, ISKNV) 屬於虹彩病毒科，可以使多種魚類得傳染性脾腎壞死病，造成鱖魚、石斑、卵形鯧鰺等大量 死亡，感染後10天內死亡可達90%以上，給養殖魚類帶來很大的經濟損失。
[0003] 目前控制該病的最好方法為疫苗免疫，但國內外尚無有效藥物。全病毒滅活疫苗 的效果不理想，保護率一般不超過50%。日本、韓國有報導採用DNA疫苗控制與ISKNV相似 的其它虹彩病毒，並取得一定的成效。但DNA疫苗的使用具有危險性，不能直接進入人類的 食物鏈。有學者採用大腸桿菌表達ISKNV的結構蛋白，製備亞單位疫苗，取得一定的效果， 但也達不到產業生產對疫苗的要求。因此，提高ISKNV基因工程疫苗的免疫效力，開發新的 疫苗具有緊迫性。
[0004] 科學研究證明病毒樣顆粒（VLPs)具有很好的免疫效力和應用前景。VLPs是含有 某種病毒的一個或多個主要結構蛋白，在體外表達系統中自動組裝成的不包含病毒核酸的 空心顆粒。流感病毒的表面膜蛋白HA是引起機體產生免疫應答的主要誘發物，而基質蛋白 Ml是形成病毒外殼的主體，亦可作為組織型免疫應答的誘發物。有關的研究證明，基質蛋白 Ml的正確表達，是保證病毒外殼形成的重要環節。Ml蛋白和HA這2個主要結構蛋白同時 表達就可以自動組裝成空心的沒有病毒基因組的病毒樣顆粒。VLPs的形態和大小與真實的 病毒粒子相同或相似，所以能有效的誘導機體免疫系統產生免疫保護反應，作為一種新型 疫苗顯示出了良好的應用前景。


【發明內容】

[0005] 有鑑於此，有必要針對上述疫苗效力差等問題，提供一種傳染性脾腎壞死病毒的 病毒樣顆粒和疫苗及其製備方法。
[0006] 為了實現上述目的，本發明採用如下技術方案：
[0007] -種抗傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒，由同時表達的流感病毒基質蛋白Ml 和融合蛋白HA-24構成；所述融合蛋白HA-24由流感病毒HA蛋白與魚類傳染性脾腎壞死病 毒0RF24構建而成，所述融合蛋白HA-24的核酸序列如SEQ ID N0:3、5、7、9或11所示。
[0008] -種抗傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒的製備方法，包括以下步驟：
[0009] ①將傳染性脾腎壞死病毒主要結構蛋白0RF24基因替換流感病毒HA基因的一部 分，二者構成融合基因 HA-24,融合基因 HA-24的核酸序列如SEQ ID N0:3、5、7、9或11所 示；
[0010] ②將流感病毒的基質蛋白Ml基因和融合蛋白HA-24基因插入昆蟲杆狀病毒 pFastBac-Dual載體上，經酶切鑑定及測序，篩選出陽性重組載體，並轉化含有杆狀病毒穿 梭載體的DHlOBac感受態細胞，獲得重組杆狀病毒穿梭載體rBacmid ;
[0011] ③利用脂質體轉染試劑，將含外源基因的重組杆狀病毒穿梭載體rBacmid轉染入 宿主昆蟲細胞株sf-9中，獲得重組昆蟲杆狀病毒；
[0012] ④培養受重組昆蟲杆狀病毒轉染的宿主昆蟲細胞，使其得以高效地表達流感病毒 的結構蛋白Ml和融合蛋白HA-24,並自動組裝成同時表達流感病毒基質蛋白Ml和融合蛋白 HA-24的病毒樣顆粒。
[0013] 優選地，步驟①中的HA-24基因是由傳染性脾腎壞死病毒0RF24與流感病毒HA基 因先合成融合基因，然後用PCR擴增而成。
[0014] 優選地，步驟③中Sf-9細胞在27°C培養4-5天，收集細胞培養上清液，再侵染新的 sf-9細胞，獲得放大後高滴度的重組昆蟲杆狀病毒。
[0015] 優選地，步驟④中受重組昆蟲杆狀病毒轉染的宿主昆蟲細胞在27°C培養3天，表 達的流感病毒Ml蛋白和融合蛋白HA-24,自動組裝成VLPs。
[0016] 一種包含上述任一項所述的病毒樣顆粒的魚類傳染性脾腎壞死病毒基因工程疫 苗。
[0017] 本發明提供的抗傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒和疫苗及其製備方法具有明 顯的優點和效果：
[0018] (l)VLPs疫苗能引起機體免疫系統產生強型應答，免疫力強，持續時間長，能預防 魚類傳染性脾腎壞死病毒病。
[0019] (2)病毒樣顆粒不含病毒基因組，這種空殼結構的VLPs在免疫動物體內就不會發 生病毒基因與宿主染色體基因整合，而且整個生產過程不接觸活的有感染力的病毒，因此 非常安全。
[0020] (3)和一般的基因工程亞單位疫苗比較，在這種新型的病毒樣顆粒中，大量的傳染 性脾腎壞死病毒結構蛋白位於顆粒表面，能刺激機體產生更好的免疫反應，免疫效果更好。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1為本發明實施例1中PCR擴增產物電泳圖。其中，泳道1為marker，泳道2為 HA-24,泳道3為Ml，泳道4為空白對照。
[0022] 圖2為本發明實施例1中Ml和HA-24基因在懸浮培養的昆蟲細胞sf-9中表達的 Western blots圖。其中，泳道1為marker,泳道2為陰性對照，泳道3為實驗組樣品。
[0023] 圖3為本發明實施例1中純化後的病毒樣顆粒的Western blots圖。其中，泳道 1為marker，泳道2為陰性對照，泳道3為實驗組樣品。

【具體實施方式】
[0024] 本發明藉助流感病毒VLPs平臺，將魚類傳染性脾腎壞死病毒的主要結構蛋白 0RF24與流感病毒HA的一部分融合形成一個新的融合蛋白HA-24,然後在昆蟲細胞中同時 表達HA-24和Ml蛋白，自動組裝成VLPs。以表達融合蛋白HA-24的VLPs作為抗原，製備一 種預防魚類傳染性脾腎壞死病毒的新型基因工程疫苗。本發明新型的魚類傳染性脾腎壞死 病毒基因工程疫苗還可以包括佐劑。
[0025] 本發明以Bac-to-Bac昆蟲杆狀病毒表達系統為基礎，將流感病毒HA蛋白與魚類 傳染性脾腎壞死病毒0RF24構建成融合蛋白HA-24,同時表達流感病毒基質蛋白Ml和融合 蛋白HA-24,二者共同自動組裝構建出類似流感病毒的VLP空殼粒子。
[0026] 首先，將魚類傳染性脾腎壞死病毒0RF24基因替換流感病毒HA基因的一部分，二 者構成融合基因（HA-24)，0RF24基因位於融合基因 HA-24的5'端，替換相等長度的HA基 因的5'端序列，以保障融合基因 Η A-24的長度與HA基因長度大致相等。
[0027] 然後，按照形成流感病毒樣顆粒的方法，將流感病毒的基質蛋白Ml和融合蛋白 HA-24的DNA片斷，構建於昆蟲杆狀病毒的載體質粒內，並使其重組入昆蟲杆狀病毒的遺傳 物質DNA內，利用宿主昆蟲細胞表達這些外源蛋白，自動組裝成不含流感病毒遺傳物質的 病毒樣顆粒，病毒樣顆粒形成後將釋放入細胞培養液中。這樣形成的VLPs具有傳染性脾腎 壞死病毒0RF24蛋白。
[0028] 實施例1抗傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒
[0029] 1、Ml基因和HA-24的擴增
[0030] 1. 1融合基因 HA-24的合成
[0031] 將傳染性脾腎壞死病毒主要結構蛋白基因0RF24替換H1N1流感病毒HA蛋白基因 的一部分，二者構成融合基因（HA-24)，0RF24基因位於融合基因 HA-24的5'端，替換相當 長度的HA基因的5'端序列，以保障融合基因 HA-24的長度與HA基因長度大致相等。融合 序列中0RF24和HA序列的長度可做相應的調整。融合基因的核酸序列如SEQ ID N0:3所 示，其胺基酸序列如SEQ ID N0:4所示。SEQ ID N0:3的第1-936位鹼基為0RF24的基因， 第937-1701位鹼基為HA的基因 ；SEQ ID N0:4的第1-312位胺基酸為0RF24的胺基酸，第 313-566位鹼基為HA的胺基酸。融合基因根據其核酸序列人工合成。
[0032] 1. 2流感病毒RNA抽提和RT-PCR
[0033] 流感病毒RNA的提取按GibcoBRL公司TRIzol LS Reagent RNA提取試劑盒的使用 說明書（方法）進行。分別取250yL流感病毒H1N1亞型毒株感染尿囊液和750yL TRIzol LS，加入1. 5 mL微量離心管內，用吸管吹打充分混勻，室溫放置10min ;加入200 μ L氯仿，劇 烈振蕩15s，室溫靜置5分鐘後，4°C下12000rpm離心15min ;取上清於一新的滅菌1. 5mL離 心管內，加入500 μ L異丙醇，充分混勻，室溫放置10min，在4°C下12000r/m離心10min ;傾 去上清，沉澱中加入70 %的乙醇750 μ L，輕輕混勻，洗滌一次，4°C下12000r/m離心15min， 棄去上清，風乾；加入10yL用DEPC水處理的無 RNA酶的三蒸水溶解病毒RNA (沉澱），直 接用於RT-PCR或-80°C保存備用。
[0034] RT-PCR參照TaKaRa的AMV反轉錄酶的使用說明進行，在20 μ L反應體系中分別 加入以下組分：RNA :3μ L ;5XRT buffer :4μ L ;dNTPs :4μ L ;RNA 酶抑制劑：0· 5μ L ;引物 UP :1μ L ;引物DN:ly L ;AMV :2μ L ;DEPCtK :補至 20μ L。混勻後，室溫放置 10min，42°C保 溫lh，冰浴2min，RT產物直接用於PCR擴增或-20°C保存。
[0035] 1. 3HA-24 和 Ml 基因的 PCR 擴增
[0036] 根據Ml基因序列（SEQ ID N0:1，其蛋白序列為SEQ ID N0:2)設計的1對引物， 用於擴增Ml基因，其兩端分別加上了 Sal I和Hind III的酶切位點位於PPH啟動子下，這2 個引物序列（SEQ ID N0:13-14)分別是：
[0037] MISal I :5, -GCCGTCGACATGAGTCTTCTAACCGAG-3'
[0038] MIHind III : 5，-GCCAAGCTTTCACTTGAATCGTTG-3，
[0039] 根據融合基因 HA-24的序列（SEQ ID NO:3)設計的1對引物，用於擴增融合基因 HA-24,其兩端分別加上了 Xho I和Sph I酶切位點，位於P10啟動子下，引物序列（SEQ ID NO: 15-16)如下：
[0040] H Xhol I:5'-GG CTCGATATGGATAAGTATGTGCTCAG-3'
[0041] H Sph I:5,-ACAT GCATGCTTAAATACATATTCTGCACT-3'
[0042] 採用Ml和HA-24各自特異性引物，將反轉錄產物或合成的DNA片斷直接用作PCR 擴增Ml和HA-24基因的模板。PCR反應條件為94°C預變性3min，94°C變性40S，56°C退火 908,721：延伸908，循環30次，最後延伸101^11，？〇?產物用1.5%瓊脂糖凝膠（含0.5即/ mL溴化乙錠，EB)電泳檢測。電泳結果如圖1所示，PCR擴增的Ml基因的長度約0. 75Kb，融 合基因 HA-24的長度約為1. 7Kb。
[0043] 所有的PCR產物樣品經電泳凝膠抽提後，獲得純化的Ml和HA-24基因 DNA片段， 經限制性內切酶3&11/把11(1111(消化組片段）、乂11〇1和5?111(消化撤-24片斷）371： 分別消化後，再進一步純化，以備構建重組質粒用。具體操作如下：製備1%瓊脂糖凝膠含 0. 5ug/mL溴化乙錠，將所有PCR樣品加入凝膠的樣品槽內，設置電壓100V，電泳時間40min 在長波紫外燈下，切下含有樣品帶的凝膠條，裝入小塑料離心管中。參照膠回收試劑盒 (Qiagen公司產品）說明書，抽提純化Ml和HA-24基因 DNA片段。經限制性內切酶37°C過 夜消化後，用膠回收試劑盒（Qiagen公司產品），按照說明書指導，離心過柱，純化回收酶切 消化後的Ml和HA-24片段。
[0044] 2、構建表達Ml和HA-24基因的昆蟲杆狀病毒表達質粒及在昆蟲細胞中合成重組 的昆蟲杆狀病毒
[0045] 2. 1構建表達Ml的重組質粒
[0046] 昆蟲杆狀病毒質粒PFastBac-dual (Invitrogen公司產品）經限制性內 切酶Sal I /Hind III 37°C酶切3小時後，用膠回收試劑盒回收純化酶切後的質粒 PFastBac-dual。在T4DNA連接酶的作用下，酶切後的質粒與酶切後的M1DNA片段於16°C 連接過夜。反應體系如下：1〇ΧΤ4連接緩衝液lmL，Ml酶切回收的DNA片段3mL，酶切 PFastBac-dual質粒回收產物1 μ L，T4DNA連接酶1 μ L，ddH20補至10 μ L。採用熱休克方 法將連接產物轉導入ToplO感受態細胞中加入到於一小塑料離心管中，輕輕混合後將小管 置於冰上30min，轉入42°C水浴中熱休克90s，迅速放回冰上5分鐘，向其中加入200 μ LLB 培養液。37°C搖床培養1小時。取100 μ L菌液塗布於LB固體培養基（含有氨苄和慶大黴 素兩種抗生素）上，37°C培養16h，從平板上挑取陽性克隆菌落，進行菌液PCR，抽提質粒後 用5 &11/把11(1111進行單或雙酶切鑑定。0嫩序列測定後，獲得重組質粒？?&8丨8 &(3-(1皿這1。
[0047] 2. 2構建表達HA-24和Ml基因的重組質粒
[0048] 重組質粒PFastBac-dualMl經限制性內切酶Xho I /Nco I酶切後，在T4DNA連接 酶的作用下，將被同樣的內切酶消化後的HA-24基因 DNA片段插入到P10啟動子的下方，此 連接產物隨後經熱體克法轉導入ToplO感受態細胞中，培養、抽提數個陽性克隆菌落的重 組質粒DNA，菌液PCR和Xho I /Nco I酶切鑑定及DNA序列測序確定無誤後，獲得二度重組 的質粒。DNA測序後，S卩為所需的重組昆蟲杆狀病毒表達質粒PFastBac-dual-Ml-HA-24。
[0049] 2. 3重組昆蟲杆狀病毒基因組的合成及提取
[0050] 將純化的重組PFastBac-dual-Ml-HA-24質粒轉導入特殊的E. coli感受態細胞 株DHlOBac細胞中（美國Invitrogen公司產品）。DHlOBac細胞含有一特殊的大分子質粒 Bacmid，其內包含有昆蟲杆狀病毒AcMNPV的全部基因組。一旦重組的表達質粒整合入大 分子質粒Bacmid的特別位點後，經3種抗菌素（慶大黴素、四環素和卡那黴素）的篩選及 IPIG的誘導和X-Gal底物反應進行藍白斑篩選，陽性克隆菌落呈白色，而非重組的野生菌 落呈蘭色。實驗條件均按照Invitrogen公司提供的實驗手冊指導而設定。挑選的陽性克 隆置於3mL的LB培養液中（含上述3種抗生素），經37°C搖床培養24小時，按照實驗手冊 標明的大分子質粒Bacmid小量製備法，提取純化帶有Ml基因和HA-24基因的重組大分子 質粒 Bacmid〇
[0051] 2. 4重組昆蟲杆狀病毒的製備
[0052] 將昆蟲細胞株sf-9細胞（美國Invitrogen公司產品）培養於無血清的sf-900II 昆蟲細胞培養液中（Invitrogen公司產品），溫度設置為27°C，根據Invitrogen公司提 供的實驗手冊，細胞密度為5xl0 5個/mL，採用脂質體轉染法，將純化的重組大分子質粒 Bacmidl μ g與脂質溶液cellfectin (Invitrogen公司產品）6 μ L混合入200 μ L的無血清 無雙抗的培養基中，轉染sf-9細胞，27°C培養4至5天後，收集細胞培養上清液，3000r/m離 心10分鐘收集上清液除去細胞碎片，獲得低滴度的重組昆蟲杆狀病毒，再用此上清液感染 新培養的sf-9細胞（每毫升上清液感染4xl0 6個sf-9細胞）；3天後收集細胞培養上清液， 即為所需的放大培養後的高濃度重組昆蟲杆狀病毒，命名為Bac-Ml-HA-24。
[0053] 對獲取的用於放大培養和蛋白表達的重組昆蟲杆狀病毒進行蝕斑實驗，確定病毒 的噬斑形成單位（plaque forming units, PFU)，具體步驟為：
[0054] 1)用含10% FBS的Grace' s培養基將Sf-9細胞傳代接種到六孔培養板中，細胞 密度為約IX 1〇6個cells/mL，每孔加2mL(6孔板），輕輕混勻室溫使細胞貼壁1小時以上。
[0055] 2)將P3代種毒液用不含FBS的Grace' s培養基做10倍倍比稀釋待用。
[0056] 3)棄去六孔板中的培養基，用不含血清的培養基清洗細胞3次，然後將上述稀釋 好的重組病毒液加入孔中，每個稀釋度做兩個復孔，室溫下感染1小時。
[0057] 4)製備覆蓋液（以下為一塊六孔板的量）：7mL2XGrace' s medium+140 μ 1的雙 抗+7mL2%的高壓滅菌agarose膠+1. 4mL FBS，輕輕地混勻，然後將瓶再放置42°C水浴，病 毒感染lh後吸盡每孔中的病毒液，並快速用上述製備的覆蓋液覆蓋細胞。
[0058] 5)待瓊脂糖凝固後將六孔板用保鮮膜包好並置於27°C培養箱中培養3-5天。
[0059] 6)加入lmL濃度為lmg/mL的中性紅，室溫孵育2小時後吸去染液，觀察到重組病 毒形成的近似透明的小點即為空斑。計算統計觀察病毒空斑的形成情況（PFU)，病毒的滴度 約為 4. 5X109(PFU/mL)。
[0060] 3、Ml和HA-24基因在懸浮培養的昆蟲細胞sf-9中的表達
[0061] 將200mL sf-9細胞混合液懸浮培養於1升體積的三角搖瓶中，細胞培養液為無血 清的 sf_900II(或 Invitrigen 公司的 Grace insect medium),搖床搖速為 100r/m，溫度 恆定於27°C。當細胞濃度達到2X1細胞/mL時，用Bac-Ml-HA-24昆蟲杆狀病毒DNA轉染 sf-9細胞，病毒的Μ0Ι = 1。轉染的細胞經恆溫搖動培養3天後，收集所有樣品，4°C離心30 分鐘，離心速度為3000r/m，收集細胞培養上清液。離心下來的細胞沉澱物用細胞裂解液處 理後，4°C離心10分鐘，離心速度為10, 000r/m，保留離心後的細胞裂解抽提上清液。實驗進 行的同時構建合成的野生型昆蟲杆狀病毒用於轉染懸浮培養的sf-9細胞，MOI = 1，作為設 置的陰性對照，轉染後的細胞培養、樣品的收集及細胞裂解的條件與步驟與上述實驗一樣。
[0062] 收集的所有樣品用於Western blots分析。其實驗操作如下：
[0063] 1)每個樣品（包括陰性對照）分別取10 μ L的細胞裂解抽提上清液，再各自加入 10 μ L的2ΧSDS上樣緩衝液。100°C處理5min後，將所有20 μ L的混合樣品加入4% -12% SDS聚丙烯醯胺凝膠的點樣孔中。設置恆定電壓120V，溫度為4°C，時間3小時，當藍色指示 劑溴酚蘭完全靠入凝膠底端時，停止電泳，取出凝膠。
[0064] 2)剪一張與凝膠相同大小的硝酸纖維素膜（PVDF膜）及兩張濾紙，PVDF膜用甲醇 浸泡5分鐘後與凝膠、濾紙一起浸入預冷2小時以上的轉移緩衝液中，按濾紙--凝膠-- 硝酸纖維素膜--濾紙的順序安裝入轉印夾。將夾中靠近凝膠的一側接負極，恆壓25V轉 移電泳lh.用鑷子夾取出硝酸纖維素膜，用PBS-T漂洗液洗滌，而後轉移至5%的脫脂奶粉 /PBS溶液中，搖蕩封閉1小時。
[0065] 3)用PBS-T漂洗液洗滌3次，每次3分鐘；然後將硝酸纖維素膜轉入一塑膠袋中， 加入3mL以1:500稀釋於5%脫脂奶粉/PBS中抗H1N1流感病毒雞源多克隆抗體（一抗）， 置於4°C平緩搖動過夜。翌日，取出纖維素膜，用PBS-T漂洗液洗滌3次，每次10分鐘，將此 硝酸纖維素膜再裝入另一新的塑膠袋中，加入5mL以1:10000稀釋於5%脫脂奶粉/PBS中 的辣根過氧化物酶標記的驢抗雞IgG(二抗），室溫下搖動溫育lh。棄二抗，PBS-T漂洗纖 維素膜3次，每次10分鐘，將漂洗後的硝酸纖維素膜移至一平皿中，加入DAB第五顯色液。
[0066] 如圖2所示，在相對應的分子量位置上有Ml (約25KDa)和HA-24 (約70KDa)的特 異性條帶。說明Ml和HA-24在轉染的懸浮培養的SF-9昆蟲細胞中有效地表達了。
[0067] 4、病毒樣顆粒的純化
[0068] 將上述離心收集的細胞培養上清液裝入13mL的超速離心管內，稱重、平衡、封管 後，放入超速離心機（Bechmem公司產品）內，4°C 100, OOOrpm離心1小時，然後取出離心管， 小心倒掉上清液，保留離心管底的深沉物。加入5mL的PBS，放入4°C冰箱內，溶解24小時。 次日，在另一個13mL的超速離心管內，先小心地加入lmL 60%的庶糖溶液，然後依次加入 lmL 30%及3mL20%的庶糖溶液，最後將5mL的溶解後的樣品液置於其上。精確稱重、平衡 後，封管上超速離心機。4°C 100, OOOrpm離心1小時。取出離心管，收集位於30%與60% 濃度交界處的條帶，即純化的病毒樣顆粒。
[0069] Western blots分析純化濃縮後的病毒樣顆粒樣品。其操作步驟與上述步驟3中 Western blots分析一樣，只是將所取的樣品進行了稀釋，S卩lyL的病毒樣顆粒樣品，加入 9 4 1^的水，再加入1(^1^的2父505上樣緩衝液。1001：變性51^11後，上樣入4%-12%聚丙 烯醯氨凝膠樣品槽內。由圖3Western blots結果顯示，所獲得的大分子顆粒，的確是由Ml 和HA-24構成的病毒樣顆粒。說明轉染後，病毒樣顆粒在宿主細胞中有效地自我組裝，並釋 放入細胞培養上清液中。
[0070] 實施例2抗傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒
[0071] 將傳染性脾腎壞死病毒主要結構蛋白基因0RF24替換H1N1流感病毒HA蛋白基因 的一部分，二者構成融合基因（HA-24)，0RF24基因位於融合基因 HA-24的5'端，替換相當 長度的HA基因的5'端序列，以保障融合基因 HA-24的長度與HA基因長度大致相等。融合 序列中0RF24和HA序列的長度可做相應的調整。融合基因的核酸序列如SEQ ID N0:5所 示，其胺基酸序列如SEQ ID N0:6所示。SEQ ID N0:5的第1-906位鹼基為0RF24的基因， 第907-1701位鹼基為HA的基因 ；SEQ ID NO:6的第1-302位胺基酸為ORF24的胺基酸，第 303-566位鹼基為HA的胺基酸。融合基因根據其核酸序列人工合成。其他實驗步驟和實驗 條件與實施例1相同。
[0072] 實施例3抗傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒
[0073] 將傳染性脾腎壞死病毒主要結構蛋白基因0RF24替換H1N1流感病毒HA蛋白基因 的一部分，二者構成融合基因（HA-24)，0RF24基因位於融合基因 HA-24的5'端，替換相當 長度的HA基因的5'端序列，以保障融合基因 HA-24的長度與HA基因長度大致相等。融合 序列中0RF24和HA序列的長度可做相應的調整。融合基因的核酸序列如SEQ ID N0:7所 示，其胺基酸序列如SEQ ID N0:8所示。SEQ ID N0:7的第1-876位鹼基為0RF24的基因， 第877-1701位鹼基為HA的基因 ；SEQ ID N0:8的第1-292位胺基酸為0RF24的胺基酸，第 293-566位鹼基為HA的胺基酸。融合基因根據其核酸序列人工合成。其他實驗步驟和實驗 條件與實施例1相同。
[0074] 實施例4抗傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒
[0075] 將傳染性脾腎壞死病毒主要結構蛋白基因0RF24替換H1N1流感病毒HA蛋白基因 的一部分，二者構成融合基因（HA-24)，0RF24基因位於融合基因 HA-24的5'端，替換相當 長度的HA基因的5'端序列，以保障融合基因 HA-24的長度與HA基因長度大致相等。融合 序列中0RF24和HA序列的長度可做相應的調整。融合基因的核酸序列如SEQ ID N0:9所 示，其胺基酸序列如SEQ ID NO: 10所示。SEQ ID N0:9的第1-846位鹼基為0RF24的基因， 第847-1701位鹼基為HA的基因 ；SEQ ID N0:10的第1-282位胺基酸為0RF24的胺基酸， 第283-566位鹼基為HA的胺基酸。融合基因根據其核酸序列人工合成。其他實驗步驟和 實驗條件與實施例1相同。
[0076] 實施例5抗傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒
[0077] 將傳染性脾腎壞死病毒主要結構蛋白基因0RF24替換H1N1流感病毒HA蛋白基因 的一部分，二者構成融合基因（HA-24)，0RF24基因位於融合基因 HA-24的5'端，替換相當 長度的HA基因的5'端序列，以保障融合基因 HA-24的長度與HA基因長度大致相等。融合 序列中0RF24和HA序列的長度可做相應的調整。融合基因的核酸序列如SEQ ID N0:11所 示，其胺基酸序列如SEQ ID NO: 12所示。SEQ ID NO: 11的第1-816位鹼基為0RF24的基 因，第817-1701位鹼基為HA的基因 ；SEQ ID NO: 12的第1-272位胺基酸為0RF24的氨基 酸，第273-566位鹼基為HA的胺基酸。融合基因根據其核酸序列人工合成。其他實驗步驟 和實驗條件與實施例1相同。
[0078] 實施例6疫苗免疫試驗
[0079] 將實施例1-5純化的病毒樣顆粒（VLPs)與佐劑（M0NTANIDE ISA 763A, seppic, France)等體積混合製成VLPs疫苗，4°C保存備用。
[0080] 280尾卵形鯧鰺（金鯧魚）平均體重100g，飼養於水泥池中，隨機分為7組。第 1?5組為試驗組，分別免疫實施例1?實施例5製備的VLPs疫苗，每尾注射0. lmL (含抗原 50ug) VLPs疫苗；第6組注射PBS溶液與等量佐劑混合而成的陰性對照疫苗（不含抗原）； 第7組不注射疫苗。免疫方式為背部肌肉注射。免疫後28天尾靜脈採血，每組5尾，常規 分離血清，以純化的傳染性脾腎壞死病毒為抗原，採用ELISA方法檢測血清中抗體。
[0081] 結果表明，第6、7組抗體為陰性，第1?5組樣品全部為陽性，平均ELISA滴度分 別為：第 1 組 2700±360,第 2 組 2693±425,第 3 組 2599±410,第 4 組 2812±393,第 5 組 2581±403，說明￥1^8疫苗能刺激產生高滴度抗體。免疫後30天，用111051'(：10 5(|15謂￥病毒 攻毒，觀察3周。結果顯示，第1組死亡8尾，存活32尾；第2組死亡8尾，存活32尾；第3 組死亡9尾，存活31尾；第4組死亡7尾，存活33尾；第5組死亡10尾，存活30尾；第6、 7組在14天內全部死亡，表明VLPs疫苗對卵形鯧鰺具有較好的保護作用，可以預防傳染性 脾腎壞死病毒對卵形鯧鰺的感染。
[0082] 以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但並 不能因此而理解為對本發明專利範圍的限制。應當指出的是，對於本領域的普通技術人員 來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬於本發明的保 護範圍。因此，本發明專利的保護範圍應以所附權利要求為準。
【權利要求】
1. 一種抗傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒，其特徵在於，所述病毒樣顆粒由同時表 達的流感病毒基質蛋白Ml和融合蛋白HA-24構成；所述融合蛋白HA-24由流感病毒HA蛋 白與魚類傳染性脾腎壞死病毒0RF24構建而成，所述融合蛋白HA-24的核酸序列如SEQ ID N0:3、5、7、9 或 11 所示。
2. -種抗傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒的製備方法，其特徵在於，包括以下步 驟： ① 將傳染性脾腎壞死病毒主要結構蛋白0RF24基因替換流感病毒HA基因的一部分，二 者構成融合基因 HA-24,融合基因 HA-24的核酸序列如SEQ ID N0:3、5、7、9或11所示； ② 將流感病毒的基質蛋白Ml基因和融合蛋白HA-24基因插入昆蟲杆狀病毒 pFastBac-Dual載體上，經酶切鑑定及測序，篩選出陽性重組載體，並轉化含有杆狀病毒穿 梭載體的DHlOBac感受態細胞，獲得重組杆狀病毒穿梭載體rBacmid ; ③ 利用脂質體轉染試劑，將含外源基因的重組杆狀病毒穿梭載體rBacmid轉染入宿主 昆蟲細胞株sf-9中，獲得重組昆蟲杆狀病毒； ④ 培養受重組昆蟲杆狀病毒轉染的宿主昆蟲細胞，使其得以高效地表達流感病毒的 結構蛋白Ml和融合蛋白HA-24,並自動組裝成同時表達流感病毒基質蛋白Ml和融合蛋白 HA-24的病毒樣顆粒。
3. 根據權利要求2所述的流感病毒和傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒的製備方法， 其特徵在於，步驟①中的HA-24基因是由傳染性脾腎壞死病毒0RF24與流感病毒HA基因先 合成融合基因，然後用PCR擴增而成。
4. 根據權利要求2所述的流感病毒和傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒的製備方 法，其特徵在於，步驟③中sf-9細胞在27°C培養4-5天，收集細胞培養上清液，再侵染新的 sf-9細胞，獲得放大後高滴度的重組昆蟲杆狀病毒。
5. 根據權利要求2所述的流感病毒和傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒的製備方法， 其特徵在於，步驟④中受重組昆蟲杆狀病毒轉染的宿主昆蟲細胞在27°C培養3天，表達的 流感病毒Ml蛋白和融合蛋白HA-24,自動組裝成VLPs。
6. -種包含權利要求1-5任一項所述的病毒樣顆粒的魚類傳染性脾腎壞死病毒基因 工程疫苗。
【文檔編號】A61K39/12GK104195119SQ201410381379
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月5日 優先權日:2013年8月6日
【發明者】曹永長, 薛春宜, 劉大才 申請人:中山大學