一種應用於腫瘤細胞和幹細胞共培養的新方法
2023-08-04 03:59:36 3
專利名稱：一種應用於腫瘤細胞和幹細胞共培養的新方法
技術領域：
本發明涉及一種腫瘤細胞與幹細胞相互作用的體外實驗新方法，尤其是涉及腫瘤細胞與 幹細胞的非接觸式共培養。
背景技術：
間充質幹細胞(mesenchymal stem cells, MSC)是指存在於骨髓基質中的非造血組織的 另一類重要的幹細胞，它最顯著的生物學特徵是既有自我更新的能力，又具有向多種中胚層 和神經外胚層來源的組織細胞分化的潛能。它有著廣泛的來源包括骨髓、骨骼肌、軟骨、 骨、肌腱等，故在幹細胞研究領域中具有突出的優勢，具有非常重要的理論研究意義和臨床 應用價值。
我們希望通過以transwell模型為基礎，建立MSC細胞和惡性黑色素瘤細胞的非接觸式共 培養模型，觀察不同培養模型中的MSC形態，檢測多種指標免疫組織化學染色結果、分析差 異，初步表明與惡性黑色素瘤細胞非接觸式共培養的部分MSC表型發生改變，明確非接觸式 共培養可以應用於MSC和惡性黑色素瘤細胞之間相互作用的研究。
本實驗中培養的間充質幹細胞緊密貼壁生長，形態較均一，其形態特徵基本上為梭形的 成纖維細胞狀，符合骨髓間充質幹細胞形態。細胞CD34及M因子陰性，排除了造血細胞和內 皮細胞的可能性。綜合分析上述結果證明本次實驗對照模型中培養的細胞符合小鼠骨髓間充 質千細胞的特點，是未產生分化小鼠骨髓來源間充質幹細胞。
血管內皮是指血管內壁覆蓋的一層上皮細胞，具有許多重要標誌，主要包括VDI因子關 連抗原(von willebrand factor, vWF)，可以由全身所有血管內皮細胞產生，檢測這一因子主 要用相應的抗體。vWF具有很高的特異性，通常認為它是反映內皮細胞的最好指標，如人的 vWF抗體對牛的內皮細胞沒有交叉反應。
本次實驗中非接觸式共培養的MSC光鏡下部分細胞為多角形或短梭形；免疫組織化學和 免疫螢光結果呈現CD34陽性，VIII因子陽性，並且通過統計分析得到共培養模型與對照模 型在CD34和VIII因子2個指標上均有顯著差異(P<0. 01)。以上結果初步證實與B16非接 觸式共培養中的MSC部分細胞發生向內皮細胞方向分化。
此次實驗藉助transwell模型建立了非接觸式共培養模型，此種培養模型排除了以往接觸 式共培養模型的細胞混雜不利於後期觀察和區分結果的弊端，細胞分類明確，變化一目了然。
而且當培養模型中細胞間相互作用需要通過建立細胞間緊密連接和/或需要採用旁分泌的作 用方式時，則不會引起靶細胞變化。根據非接觸式共培養的特點，可以進一步推測惡性黑色 素瘤細胞是否通過向共同培養體系中分泌較高含量的某種或某些細胞因子對MSC產生作用， 導致MSC的分化。
綜上所述，本實驗通過新建的體外非接觸式共培養模型，初歩表明與惡性黑色素瘤細胞 非接觸式共培養的部分MSC表型發生改變，明確非接觸式共培養可以應用於兩種細胞間相互 作用及作用方式的研究。雖然，通過本方法還無法說明B16誘導MSC分化的具體方式以及 確切機制，但是我們認識了MSC在腫瘤血管形成中的作用，以及非接觸式共培養在研究細胞 間相互作用及作用方式的重要意義。
發明內容
通過建立MSC細胞和惡性黑色素瘤細胞的非接觸式共培養模型，觀察不同培養模型中的 MSC形態，檢測多種指標免疫組織化學染色結果、分析差異，初步表明與惡性黑色素瘤細胞非 接觸式共培養中的部分MSC表型發生改變，明確非接觸式共培養可以應用於MSC和惡性黑色素 瘤細胞之間相互作用的研究。
本發明解決其技術問題所採用的技術方案是主要利用0.4 u m孔徑的Transwdl培養板 建立非接觸式共培養模型。
該模型建立步驟如下向MSC細胞培養瓶和B16細胞培養瓶中加入0.25%的胰蛋白酶 /EDTA液5ml，消化細胞5~7分鐘，配製成MSC濃度為3. 0X 1(^個/ml的非接觸式共培養 MSC預培養工作液和B16濃度為7. 5X 10"個/ml的非接觸式共培養B16預培養工作液。將對 應的lml非接觸式共培養MSC預培養工作液加入transwell預培養孔中，先將0. lml非接觸 式共培養B16預培養工作液加入transwell中的共培養插件(insert)中，再將0.6ml正常10。/0 血清的a-MEM完全培養基(卯。/。a-MEM+10。/。胎牛血清+2。/。雙抗)，沿共培養插件(insert)與 下層小室之間的側壁緩緩注入，即可達到共培養插件(insert)內外液面的平衡，完成預培養 加樣。加樣完成後充分搖晃混勻細胞，蓋緊transwell培養板蓋。放在恆溫C02孵育箱中培養， 進行預培養孵育24小時。預培養24小時後，將tmnswell培養板從孵育箱中取出。將各孔及 insert中原有的培養液吸去，向MSC預培養孔中加入0. 6ml的5%血清的a-MEM低血清完全 培養基(5%胎牛血清+約95% a-MEM+2。/。雙抗)，將裝載有B16細胞的insert —一對應放入MSC 預培養孔中，向每個insert中緩緩加入0. lml的5%血清的a-MEM低血清完全培養基(5%胎 牛血清+約95% a-MEM+29f)雙抗)，使insert內外液面相平衡，即完成transwell非接觸式共培 養模型的建立。加液完畢，將transwell培養板輕輕搖晃混勻培養液，蓋緊培養板蓋。放在恆
溫C02孵育箱中培養，開始進行72小時非接觸式共培養。
本發明的有益效果是，可以有效地建立細胞共培養體系，有利於在共培養中分選細胞及 分別取樣，便於細胞間相互作用的研究。
下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。
圖l是本發明的transwell及其插件。
圖2是非接觸式共培養中MSC生長狀態。
圖3是非接觸式共培養中B16生長狀態。
圖4是非接觸式共培養中B16誘導MSC表達VIII因子。
圖5是非接觸式共培養中B16誘導MSC表達CD34。
具體實施例方式
1實驗材料和方法
1.1實驗動物
入小鼠源性間充質幹細胞，天津醫科大學病理教研室
人小鼠源性惡性黑色素瘤細胞B16細胞系，環湖醫院細胞室 1.2主要實驗試劑
入 CD34，兔抗小鼠IgG多克隆抗體，Santacruz公司，貨號SC-9095
入 VIII因子，兔抗小鼠IgG多克隆抗體，基因公司，貨號GA008202 1. 3主要實驗器材
入倒置相差光學顯微鏡，Olympus公司
入圖像採集系統，Nikon/Dell公司
入自動控制恆溫培養箱，Jouan公司
入 Transwell， 0.4um孑L徑，Costar公司
1. 4非接觸式共培養模型中B16細胞對MSC細胞的誘導分化作用
1. 4. 1 MSC細胞與B16細胞非接觸式共培養模型建立及非接觸式共培養實驗
選取MSC細胞和B16細胞，進行細胞計數，配製成濃度為3. 0X 10"個/ml的MSC
預培養工作液和濃度為7. 5X 104個/1111的B16預培養工作液。將lml MSC預培養工作液 加入對應的transwell預培養孔中；將0. lml B16預培養工作液加入transwell中的共培養 插件中，再將0.6ml培養基，沿側壁緩緩注入下層小室，樣品編號，預培養24小時後， 取出transwdl培養板，將各孔及共培養插件中原有的培養液吸去，向MSC預培養孔中加 入0. 6ml的培養基(10%胎牛血清+約90% a-MEM+2。/。雙抗)，將裝載有B16細胞的共培養 插件一一對應放入MSC預培養孔中，向每個共培養插件中緩緩加入0. lml的10%血清的 培養基，完成tmnswdl非接觸式共培養模型的建立。放入恆溫孵育箱中，72小時非接觸 式共培養，定期觀察細胞生長情況。
非接觸式共培養72小時後，吸淨tmnswell中的培養基，去除各孔中的共培養插件， PBS清洗2次，向各孔中加入鄉的多聚甲醛，固定30分鐘，做好標記，放入-2(TC保存 (天津醫科大學，保存時間2007年4月20日，保藏編號0420分類命名，BMSC)，作 為留取的非接觸式共培養模型MSC細胞免疫組織化學檢測樣本。 1. 4. 2 MSC細胞對照性單獨培養模型建立及單獨培養實驗
選取MSC細胞，進行細胞計數，配製成濃度為3. OXl(^個/ml的的照培養MSC工 作液。將lml單獨對照培養MSC工作液加入相應的tmnswell預培養孔中，樣品編號，預 培養24小時後，取出將transwdl培養板，將各孔及共培養插件中原有的培養液吸去，向 各孔中加入lml培養基，完成單獨培養模型的建立。放入恆溫孵育箱中培養，72小時單 獨培養，定期觀察細胞生長情況。
單獨培養72小時後，吸淨transwell中的培養基，PBS清洗2次，向各孔中加入4% 的多聚甲醛，固定30分鐘，做好標記，放入-2(TC保存，作為留取的單獨培養MSC免疫 組織化學檢測樣本。
1. 4. 3兩組實驗中MSC表面分子標記物的免疫組織化學檢測
進行共培養和單獨培養中小鼠骨髓間充質幹細胞的CD34和VIII因子指標免疫組織 化學檢測。觀察各孔的顯色情況，光學倒置顯微鏡觀察，並進行圖像採集。實驗數據以 每種指標的平均陽性細胞數和平均陽性率表示。每組數值經過標準化後，應用x2檢驗方 法對各組間差異進行比較。 2實驗結果
單獨培養實驗中可見有大量緊密貼壁生長的細胞，貼壁細胞形態主要表現為梭形細 胞，胞核呈卵圓形，細胞形態較一致，為成纖維細胞樣形態，呈較典型的MSC形態。非 接觸式共培養模型部分MSC細胞光鏡下為成纖維細胞樣形態；部分細胞為多角形或短梭
形，邊界清晰，大小較均勻，胞核圓形或橢圓形，位於細胞中央。
非接觸式共培養組B16細胞對MSC的誘導分化作用實驗中，經對比觀察單獨培養(表 1)與非接觸式共培養(表2)中96孔MSC免疫組織化學和免疫螢光結果，呈現單獨培 養組CD34陰性(陽性率4.8%)， VIII因子陰性(陽性率5.5%);非接觸式共培養組CD34 陽性(陽性率50.9%), VIII因子陽性(陽性率42.2%)。並應用SPSS統計軟體進行x2 檢驗分析共培養和單獨培養在CD34和VIII因子這2個指標間平均陽性細胞數的差別(表 3)，結果表明共培養和單獨培養在CD34和VIII因子這2個指標上有顯著差異(PO.01 )。
表l單獨培養MSC檢測指標表達情況表
表達情況
染色指標平均陽性細胞數平均陽性率 IHC染色強度
CD34 24 4.8% —~+
VIII因子 22 5.5% —~+
注平均陽性率為陽性細胞數佔400個觀察細胞的百分率。 表2非接觸式共培養MSC檢測指標表達情況表
表達情況
染色指標平均陽性細胞數平均陽性率 IHC染色強度 CD34 204 50.9%++ + + +
VIII因子 169 42.2% +~+ +
注平均陽性率為陽性細胞數佔400個觀察細胞的百分率。 表3共培養和單獨培養MSC檢測指標表達差異表
共培養組 對照組 統計分析
染色指標平均陽性 細胞數平均陽 性率平均陽性 細胞數平均陽 性率 值P值
CD3420450. 9%244. 8%198. 75<0. 01
VIII因子16942. 2%225. 5%148. 62〈0. 01
注平均陽性率為陽性細胞數佔400個觀察細胞的百分率。
權利要求
1.本新方法要基於transwell(0.4μm孔徑)建立腫瘤細胞與間充質幹細胞的非接觸式共培養模型並觀察兩種細胞的表型變化，從而明確該非接觸式共培養模型可以應用於兩種細胞之間相互作用的研究。
2. 根據權利要求l所述，利用transwell (0.4pm孔徑)建立惡性黑色素瘤細胞與間充質幹細胞的非接觸式共培養模型並觀察兩種細胞的表型變化，利用免疫組織化學 與免疫螢光檢測其VIII因子和CD34表達。間充質幹細胞在非接觸式共培養模型中 可以被腫瘤細胞誘導為多角形或短梭形，同時VIII因子和CD34表達上調。初歩表明利用transwell (0.4pm孔徑)建立的腫瘤細胞與間充質幹細胞非接觸式共培養模型中的部分細胞表型發生改變，明確該非接觸式共培養模型可以應用於間充質 幹細胞和惡性黑色素細胞之間相互作用的研究。
全文摘要
本發明一種應用於腫瘤細胞和幹細胞共培養的新方法，主要通過基於transwell的間充質幹細胞與惡性黑色素瘤細胞的非接觸式共培養，觀察到共培養中間充質幹細胞形態變化，檢測Ⅷ因子和CD34兩種指標免疫組織化學染色結果，並分析免疫組織化學染色的差異。實驗結果顯示非接觸式共培養中部分間充質幹細胞變化為多角形或短梭形；對比觀察單獨培養和非接觸式共培養在Ⅷ因子和CD342種指標免疫組織化學染色結果，統計分析表明兩培養方法間的間充質幹細胞在Ⅷ因子和CD342種指標上有顯著差異。本發明通過體外單獨培養和非接觸式共培養的比較，明確非接觸式共培養可以應用於間充質幹細胞和惡性黑色素瘤細胞之間相互作用的研究。
文檔編號C12N5/06GK101186899SQ200710059929
公開日2008年5月28日 申請日期2007年10月18日 優先權日2007年10月18日
發明者倪春生, 劉易欣, 強 古, 濤 孫, 孫保存, 張文治, 紅 戚, 欣 王, 王星輝, 趙學銘, 趙秀蘭 申請人:天津醫科大學