一種高效解磷細菌及其生產的菌劑的製作方法
2023-07-24 20:47:36
一種高效解磷細菌及其生產的菌劑的製作方法
【專利摘要】本發明提供一種自主篩選的高效解磷細菌及其生產的菌劑，屬於生物【技術領域】。該解磷細菌菌株被命名為21-III，經鑑定為伯克霍爾德氏菌（Burkholderiasp.），並將其保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.7873，該菌株的16SrDNA序列已提交GenBank資料庫，登錄號為JX857813。菌株主要生物學特徵為：革蘭氏染色陰性，菌體為杆狀，接觸酶反應陽性，氧化酶反應陽性，甲基紅反應陰性。該菌劑對土壤磷的溶出效率具有明顯的促進作用，適用於改善農作物土壤肥力，利於保護環境。
【專利說明】一種高效解磷細菌及其生產的菌劑
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種高效解磷細菌及其生產的菌劑，屬於生物【技術領域】，是利用微生物的方法提高土壤無機磷的溶出效率，適用於農田土壤溶磷效率的提高，服務於農作物生長。
【背景技術】
[0002]在農業生產上，磷是作物生長發育不可缺少的重要營養元素之一，但因土壤中的磷絕大部分呈有機或無機磷化物狀態，植物不能直接吸收利用。我國70%以上的耕地土壤缺乏有效磷，所以磷是限制植物生長及農作物增產的重要因素之一。目前在生產中多施用水溶性化學磷肥，但是磷肥施用後，容易和土壤中元素形成難溶性的磷酸鹽，大大降低磷肥的利用效率，同時化學肥料的長期施用，將造成土壤板結、水體汙染等一系列環境問題。如何挖掘土壤潛在的磷庫資源，提高磷肥利用率，降低化肥施用量及化學施肥造成的環境汙染，發展可持續生態農業，成為當前世界各國農業研究的重點問題。在這種情況下，迫切需要更環保、更安全有效的方法提高農作物生產中土壤磷的利用效率。
[0003]微生物在自然界磷的物質循環中起著重要的作用，把水不溶性的磷轉化成水可溶性磷的微生物稱為解磷微生物。微生物的解磷機制一般認為是由於微生物分泌出有機酸，這些酸既能降低PH值，又可與鐵、鋁、鈣等離子結合，從而使難溶性磷酸鹽溶解。有些微生物解磷主要是質子起作用，有些主要是有機酸起作用，而有些菌株則兩種機理都存在，還有一些菌株在生長過程中會產生一些螯合物，可溶解難溶性磷。國際上一些解磷能力強的菌株已被製成生物菌肥，進行推廣應用。我國解磷微生物的研究和應用起步相對較晚。因此微生物解磷菌劑的研究及開發對提高土壤養分利用率、改善土壤環境、調控土壤肥力、減少環境汙染、發展持續高效高產的農業具有深遠的戰略意義，解磷微生物菌劑在我國的應用前景廣闊。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是在於針對農作物土壤磷轉化率低、化學磷肥利用率低且易汙染環境等實際問題，以及生物磷肥環保有效的特點，開發研製出一種高效微生物解磷菌劑。
[0005]本發明所提供的解磷細菌菌株是由本實驗室分離篩選得到，將其編號為21-111，於2013年7月3日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼:100101)，菌種保藏號為CGMCCN0.7873，經鑑定屬於伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.)。該菌株的16S rDNA基因序列已經提交了 GenBank資料庫，登錄號為JX857813。該菌的主要生物學特徵為:革蘭氏染色陰性，菌體為杆狀，接觸酶反應陽性，氧化酶反應陽性，甲基紅反應陰性。
[0006]本發明所述的解磷菌劑的製備方法，包括以下步驟:
(I)搖瓶培養
將解磷細菌21-111在牛肉膏蛋白腖培養皿上活化，劃線、挑單菌落培養兩次後，挑取單菌落接種於試管斜面培養基上備用；將試管斜面培養基上的該菌種，接種於含有牛肉膏蛋白腖培養基的三角瓶中，進行搖瓶培養，至對數生長期。培養條件為26~32 °C、轉速140^200 rpm, 500 mL三角瓶裝液量150~300 mL，培養時間24-36 h。牛肉膏蛋白腖培養基成分為牛肉膏3 g/L、蛋白腖10 g/L、NaCL 5 g/L, pH 7.0~7.2。
[0007](2)發酵罐培養
在解磷菌劑發酵培養基中，接種上述的搖瓶菌液，接種量3.0-8.0% (體積比)，發酵培養，即製得解磷細菌菌劑。發酵培養條件為罐溫26~32 °C、罐壓0.01、.03 MPa，通氣量(0.5~I): (I~2) V/Vmin，發酵時間24-36 h。發酵結束後，培養液出罐包裝。
[0008]本發明所屬的解磷菌劑發酵培養基所含成分組成比例為:葡萄糖5~10 g/L、(NH4)2SO4 8~10 g/L、NaCl 0.1-θ.3 g/L、K2HPO4 I~3 g/L、MgS047H20 0.3~0.5 g/L、酵母膏0.1-θ.3 g/L, pH 7.0~7.2，115 °C滅菌 30 min。
[0009]有益效果使用本發明生產的高效解磷菌劑，具有生產使用成本低、使用方便的特點，能夠有效提高土壤磷的利用效率，對於改善土壤環境和肥力、提高農作物產量、減少環境汙染、發展可持續生態農業具有重要的意義。
[0010]【專利附圖】
【附圖說明】
圖1實驗室條件下菌株對磷酸鈣的溶解能力；
圖2菌劑對土壤溶磷效率的提高。
【具體實施方式】
[0011]以下通過具體實施例對本發明技術方案做進一步的說明，但不作為對本發明實施範圍的限定。
[0012]實施例1:解磷菌劑生產
(I)搖瓶培養
將解磷細菌21-111在牛肉膏蛋白腖培養皿上活化，劃線、挑單菌落培養兩次後，挑取單菌落接種於試管斜面培養基上備用；將試管斜面培養基上的該菌種，接種於含有牛肉膏蛋白腖培養基的三角瓶中，進行搖瓶培養，至對數生長期。培養條件為26~32 °C、轉速140^200 rpm, 500 mL三角瓶裝液量150~300 mL，培養時間24-36 h。牛肉膏蛋白腖培養基成分為牛肉膏3 g/L、蛋白腖10 g/L、NaCL 5 g/L, pH 7.0~7.2。
[0013](2)發酵罐培養
在解磷菌劑發酵培養基中，接種上述的搖瓶菌液，接種量3.0-8.0% (體積比)，發酵培養。發酵培養基所含成分組成比例為:葡萄糖5~10 g/L、(NH4)2SO4 8^10 g/L、NaCl 0.1-θ.3g/L, K2HPO4 1-3 g/L、MgS047H20 0.3~0.5 g/L、酵母膏 0.I~0.3 g/L, pH 7.0~7.2，115 V滅菌30 min。發酵培養條件為罐溫26~32 °C、罐壓0.01~0.03 MPa，通氣量(0.5~I): (I~2) V/Vmin，發酵時間24-36 h。發酵結束後，培養液出罐包裝，直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝，即製得解磷細菌菌劑。
[0014]實施例2:實驗室磷酸鈣溶解實驗
牛肉膏蛋白腖培養基平板活化菌種21-111後，以無機磷酸鈣作為不溶性磷源，製備無機磷培養基並接種21-111，接種比例5%，同時設置不含菌的平行體系作為對照，以排除體系自身的幹擾。定時定量取樣培養液，0.22 μ m微孔濾膜過濾後，鑰銻抗分光光度法測定可溶性磷酸鹽的含量，排除對照數值後，結果見圖1所示，表明72 h時，溶磷量最大，達到16.6μ mol/mL (以P04計)，能夠有效溶解不溶性微粒磷酸鈣。
[0015]該實施例2中，無機磷培養基配製比例為葡萄糖10 g，(NH4)2SO4 0.5 g，NaCl 0.3g, KCl 0.3 g, MgS047H20 0.3 g, FeS047H20 0.03 g, MnS044H20 0.03 g，補水至 1000 mL，調節pH至7.0，115 °C下滅菌30分鐘；使用前加入事先單獨滅菌的Ca3(PO4)2粉末，加入比例為10 g/L。培養條件為:於250 mL三角瓶中，裝入100 mL無機磷培養基，28°C、160 r/min搖床振蕩培養。
[0016]實施例3: 土壤溶磷效率 供試土壤米集自鄭州市郊區農田，米樣深度0-20 cm。米集後除雜。以30 g 土壤加入90 mL無菌水。接種21-111菌劑10 mL，為處理組；同時以接種10 mL經滅活的21-111菌劑，作為平行對照組。常溫條件下，靜置，在預定時間點取上清液，測定其中可溶性有效磷含量。結果見圖2所示。結果顯示，菌劑對土壤磷的溶解，在48 h達到最高，並且相對於對照組，在菌劑的作用下，土壤可溶性磷的含量提高了 1.87倍。
【權利要求】
1.一種高效解磷細菌菌劑，其特徵在於該微生物是屬於伯克霍爾德氏菌屬(.Burkholderia sp.)的菌株21-111, 2013年7月3日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏編號為CGMCC N0.7873。
2.權利要求1所述的該菌株的伯克霍爾德氏菌，其特徵在於，該菌株的16SrDNA序列已提交GenBank資料庫，登錄號為JX857813 ;該菌的主要生物學特徵為革蘭氏染色陰性，菌體為杆狀，接觸酶反應陽性，氧化酶反應陽性，甲基紅反應陰性。
3.一種用權利要求1所述的解磷細菌生產的解磷菌劑，是通過以下方法生產而成: (1)搖瓶培養:從保藏正常的解磷細菌斜面培養基上，挑取解磷細菌21-111，在牛肉膏蛋白腖培養皿上活化，劃線、挑單菌落培養兩次後，挑取單菌落接種於試管斜面培養基上備用；將試管斜面培養基上的該菌種，接種於含有牛肉膏蛋白腖培養基的三角瓶中，進行搖瓶培養，至對數生長期；培養條件為26-32 °C、轉速14(T200 rpm, 500 mL三角瓶裝液量150~300 mL，培養時間24~36 h ； (2)發酵罐培養:在解磷菌劑發酵培養基中，接種上述的搖瓶菌液，接種量3.0-8.0%(體積比)，發酵培養；發酵培養條件為溫度26~32 °C、罐壓0.01、.03 MPa，通氣量(0.5^1): 0-2) V/Vmin，發酵時間24~36 h ;發酵培養基所含成分組成比例為:葡萄糖5~10g/L、(NH4)2SO4 8~10 g/L, NaCl 0.1-0.3 g/L、K2HPO41~3 g/L、MgS047H20 0.3~0.5 g/L、酵母膏 0.1-0.3 g/L, pH 7.0~7.2 ；115 °C滅菌 30 min ； (3)發酵結束後，培養液出罐包裝成菌劑。
【文檔編號】C09K17/00GK103911311SQ201310294837
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2013年7月15日 優先權日:2013年7月15日
【發明者】屈建航, 屈建瑩, 郭娟, 李海峰, 周佳, 何曉冰, 翟煥趁 申請人:河南工業大學