三維立體培養和誘導骨髓間充質幹細胞成軟骨細胞的方法
2023-07-19 22:26:16
專利名稱：三維立體培養和誘導骨髓間充質幹細胞成軟骨細胞的方法
技術領域：
本發明涉及一種培養和誘導骨髓間充質幹細胞成軟骨細胞的方法。
背景技術：
骨髓是一種複雜的組織，其中含有各種造血系和非造血系的細胞。骨髓間充質幹細胞是存在於骨髓內的一種非造血系幹細胞，很容易從骨髓中分離出來，它不僅能在體外快速增殖，而且具有多向分化潛能，在特定的理化環境和細胞因子誘導下能生成各種各樣的間充質組織細胞，例如成骨細胞、成軟骨細胞、成脂肪細胞、成肌腱細胞、骨髓基質細胞以及神經細胞樣細胞等。基於以上兩大特點，骨髓間充質幹細胞在體外培養擴增以後可進行多種有目的的誘導操作，然後重新輸回體內，進行臨床治療，如治療骨折、軟骨組織損傷等，因此骨髓間充質幹細胞已成為組織工程研究和開發中應用較多的一種幹細胞。
修復軟骨組織的傳統方法是採用自體軟骨細胞，此法必須在關節鏡下切取非負重區的關節軟骨，對其中的軟骨細胞進行擴增，這種手術唯一的優點為無抗原性，但造成機體損傷很大。另外軟骨組織中絕大部分為基質，軟骨細胞數量少且難分離，體外傳代次數有限，一般最多培養3～4代，所以難以獲得大量細胞(參見楊志明.組織工程.北京化學工業出版社，2002)。Richardson等人(參見J.Bone Jnt.Surg，81-B1064-1068，1999)報導了2例用這種方法修復關節軟骨缺損後12個月的免疫組織化學分析結果，發現修復的組織區域性不均勻，深部區域為類似透明軟骨的組織，表面層類似纖維軟骨。因此目前研究者大多選擇骨髓間充質幹細胞，用於治療軟骨組織損傷的動物實驗及初步臨床實驗正在進行中。
目前，骨髓間充質幹細胞誘導成軟骨細胞普遍採取高密度聚團誘導。美國專利6,548,734中提出結締組織的構建需要高密度的種子細胞，尤其是構建軟骨。美國專利5,908,784中提到骨髓間充質幹細胞在體外具備了三維空間結構和成軟骨細胞誘導物質後即可沿著成軟骨細胞途徑分化，其中三維結構是關鍵因素，細胞之間必須通過分泌的物質相互影響。因此在關於骨髓間充質幹細胞成軟骨細胞誘導的研究中，一般將擴增後的細胞離心成細胞團，再用成軟骨細胞誘導培養基進行微團誘導。在修復軟骨缺損的研究中，則先將高密度的骨髓間充質幹細胞接種到支架材料上，然後將細胞-支架複合物接入誘導培養基中進行誘導，誘導後的複合物繼續移植入軟骨缺損處。
成軟骨細胞誘導需要大量的骨髓間充質幹細胞，為了獲得大量的骨髓間充質幹細胞，必須在體外進行長時間的傳代培養，而隨著細胞培養時間的延長，幹細胞的多向分化潛能會出現程序性丟失，消化過程中使用的胰酶也會導致細胞活性的降低。在骨髓間充質幹細胞-支架材料的應用過程中，應該考慮到該材料是否具有良好的生物相容性，是否有利於細胞與營養物質的接觸及生物活性分子的釋放，材料的孔徑和空間幾何結構是否有利於細胞的生長擴展。目前常用的幾種軟骨組織工程載體材料，例如聚乳酸和聚乙醇酸，在體內降解後的酸性產物會影響組織和細胞的生長，天然的生物材料如膠原、脫鈣骨、纖維蛋白凝膠等，由於本身的生物學特性，增加了幹擾因素，在新生軟骨的組織學和生化鑑定中難以得到正確的評價(參見衛小春等，第三屆全國組織工程學術會議暨第一屆中國國際組織工程會議論文彙編144-146)。
發明內容
本發明需要解決的技術問題是提供一種三維立體培養和誘導骨髓間充質幹細胞成軟骨細胞的方法，以克服現有技術存在的一系列問題，滿足科學研究和有關領域發展的需要。
本發明的技術構思是這樣的本發明將骨髓間充質幹細胞的成軟骨細胞誘導與微載體培養技術相結合，既可以快速大量擴增成軟骨細胞誘導所需要的種子細胞，而且以微載體為細胞支架構建成軟骨誘導的三維環境，減少了骨髓間充質幹細胞在繁多的操作步驟中可能受到的損傷和退化。
本發明的方法包括如下步驟(1)將骨髓間充質幹細胞在預置有培養基和微載體的懸浮培養裝置中懸浮培養，在攪拌懸浮狀態下擴增骨髓間充質幹細胞；所說的懸浮培養裝置包括轉瓶或生物反應器；所說的培養基為含有2％～20％體積百分比胎牛血清的α-MEM，α-MEM為已公開的培養基組成可採用市售產品，如Gibco或Sigma公司的產品；所說的微載體為Cytodex 3微載體，微載體含量以單位體積培養液中所含有的微載體質量為基準，為1～10mg/ml，優選含量為3mg/ml；培養環境為37℃、5％CO2、飽和溼度，培養時間為3～15天，每1～3天半量更換培養基，攪拌轉速為10～80rpm。
(2)然後將成軟骨細胞誘導培養基加入含收穫的Cytodex 3微載體以及在其上生長的骨髓間充質幹細胞的培養裝置中，對骨髓間充質幹細胞進行聚團成軟骨細胞誘導；其中收穫Cytodex 3微載體以及在其上生長的骨髓間充質幹細胞的方法為無菌條件下吸出培養裝置中所有培養液，成軟骨細胞誘導培養基以DMEM為基礎，添加濃度為1～10μg/ml的胰島素、1～20ng/ml的轉化生長因子β3、10～150nmol/L的地塞米松、10～100mg/ml的抗壞血酸磷酸酯、10～100mg/ml的脯氨酸、0.5～5mmol/L的丙酮酸鈉，DMEM培養基為已公開的培養基組成，可採用市售產品，如Gibco或Sigma公司的產品；所述及的聚團成軟骨細胞誘導指的是將成軟骨細胞誘導培養基緩慢加入培養裝置中，而微載體和細胞保持培養後期的聚團狀態，誘導培養環境為37℃、5％CO2、飽和溼度，誘導培養時間為14～21天，每3天半量更換誘導培養基。
(1)骨髓間充質幹細胞的微載體培養準備微載體將一定量Cytodex 3(Pharmacia)微載體放入培養裝置，用磷酸鹽緩衝溶液浸潤2次，每次30分鐘，最後浸泡在磷酸鹽緩衝液中，高壓滅菌(120℃)30分鐘。在無菌條件下吸出磷酸鹽緩衝液，加入含2％～20％體積百分比胎牛血清的α-MEM培養液，攪拌過夜；準備骨髓間充質幹細胞將培養的骨髓間充質幹細胞種子細胞用含0.02％乙二胺四乙酸和0.25％胰蛋白酶的消化液消化後，轉入含Cytodex 3的培養裝置中，調整Cytodex 3的含量為1～10mg/ml；骨髓間充質幹細胞的微載體培養骨髓間充質幹細胞接入含Cytodex 3的培養裝置中後，調整攪拌轉速為10～80rpm，於37、5％CO2的保和溼度下培養，培養時間為3～15天，每1～3天半量更換培養液。
(2)收穫骨髓間充質幹細胞微載體培養物將培養裝置中的培養液小心吸出，且保持培養物的聚團狀態。
(3)以微載體培養物為基礎的成軟骨細胞誘導配製軟骨細胞誘導培養基在DMEM培養基中加入1～10μg/ml胰島素、1～20ng/ml轉化生長因子β3、10～150nmol/L地塞米松、10～100mg/ml抗壞血酸磷酸酯、10～100mg/ml脯氨酸、0.5～5mmol/L丙酮酸鈉；成軟骨細胞誘導將配製好的成軟骨細胞誘導培養基緩慢加入培養裝置中，誘導培養14～28天，每3天半量更換誘導培養液。培養完成後取出誘導培養產物，可進行型膠原免疫組化分析，用於體內移植治療軟骨組織缺損或為科學研究提供充足的種子細胞來源。
按照本發明方法進行骨髓間充質幹細胞擴增，可在短時間內一次獲得大量的細胞，減少了常規靜態培養中由於傳代次數增加而造成的細胞多向分化潛力丟失，降低了汙染的機率，減少了細胞損傷。骨髓間充質幹細胞的成軟骨誘導需要高密度微團培養，將裝置中的培養液吸出後，保持培養物的聚團狀態，緩慢加入誘導培養液，可十分簡便地實現這一目的，且在微載體上生長的骨髓間充質幹細胞形態和功能良好。成軟骨細胞過程中細胞的分化依賴於環境中的營養物質濃度和細胞間分泌的細胞因子的相互作用，與一般的高密度微團誘導相比，這種三維誘導培養由於攪拌和微載體聚團培養物間具有一定的孔隙，因此更有利於細胞間營養物質的傳遞。在細胞生長後期，微載體會由於細胞密度的提高而出現結團現象，這對於成軟骨誘導是有利的，這種通過細胞架橋而自然形成細胞-生物材料複合物的方法簡單易行，省略了常規的將細胞接種到支架材料上的步驟，減少了由於接種率不高而導致的細胞損失，且此處使用的Cytodex 3微載體是由葡聚糖材料製成的，外層包被著共價連接的變性失活膠原，具有良好的生物相容性，誘導完成後可直接將該複合物移植入體內進行軟骨缺損修復或為科學研究提供充足的種子細胞來源。
圖1顯示骨髓間充質幹細胞在微載體上的初期生長狀況。
圖2顯示骨髓間充質幹細胞在微載體上生長後期開始出現的結團現象。
具體實施例方式
實施例1將150mg Cytodex 3微載體放入轉瓶，用磷酸鹽緩衝溶液浸潤2次，每次30分鐘，最後浸泡在磷酸鹽緩衝液中，放入高壓滅菌鍋中120℃滅菌30分鐘。轉瓶取出後在超淨工作檯中吸出磷酸鹽緩衝液，加入30ml含10％體積百分比胎牛血清的α-MEM培養液，轉瓶放入轉瓶機上攪拌過夜。將培養的骨髓間充質幹細胞種子細胞用含0.02％乙二胺四乙酸和0.25％胰蛋白酶的消化液消化後，轉入含Cytodex 3的轉瓶中，調整Cytodex 3的含量為3mg/ml，攪拌轉速為50rpm，於37℃、5％CO2、飽和溼度下培養，培養時間為4天，每天半量更換培養液。培養完成後將轉瓶中的培養液緩慢吸出，保留轉瓶中的聚團培養物。然後將配製好的成軟骨誘導培養基(DMEM培養基加6.25μg/ml胰島素、10ng/ml轉化生長因子β3、100nmol/L地塞米松、50mg/ml抗壞血酸磷酸酯、40mg/ml脯氨酸、1mmol/L丙酮酸鈉)緩慢加入轉瓶中，以防衝散聚團的微載體和細胞，調整攪拌轉速為20rpm，於37℃、5％CO2、飽和溼度下誘導培養14～28天，每3天半量更換誘導培養液。誘導完成後取出誘導培養產物，可直接用於體內移植治療軟骨組織缺損，或應用於研究和應用的其他領域。
權利要求
1.一種三維立體培養和誘導骨髓間充質幹細胞成軟骨細胞的方法，其特徵在於，包括如下步驟(1)將骨髓間充質幹細胞在預置有培養基和微載體的懸浮培養裝置中懸浮培養，在攪拌下擴增骨髓間充質幹細胞；所說的培養基為含有2％～20％體積百分比胎牛血清的α-MEM；所說的微載體為Cytodex 3微載體；(2)然後將成軟骨細胞誘導培養基加入含收穫的Cytodex 3微載體以及在其上生長的骨髓間充質幹細胞的培養裝置中，對骨髓間充質幹細胞進行聚團成軟骨細胞誘導；成軟骨細胞誘導培養基以DMEM為基礎，添加濃度為1～10μg/ml的胰島素、1～20ng/ml的轉化生長因子β3、10～150nmol/L的地塞米松、10～100mg/ml的抗壞血酸磷酸酯、10～100mg/ml的脯氨酸、0.5～5mmol/L的丙酮酸鈉。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所說的懸浮培養裝置包括轉瓶或生物反應器。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，微載體含量以單位體積培養液中所含有的微載體質量為基準，為1-～10mg/ml。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，微載體含量為3mg/ml。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，培養環境為37℃、5％CO2、飽和溼度，培養時間為3-～15天，每1-～3天半量更換培養基。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，攪拌轉速為10-～80rpm。
7.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，其中收穫Cytodex 3微載體以及在其上生長的骨髓間充質幹細胞的方法為無菌條件下吸出培養裝置中所有培養液。
8.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述及的聚團成軟骨細胞誘導指的是將成軟骨細胞誘導培養基緩慢加入培養裝置中，而微載體和細胞保持培養後期的聚團狀態。
9.根據權利要求1～8任一項所述的方法，其特徵在於，誘導培養環境為37℃、5％CO2、飽和溼度，誘導培養時間為14-～21天，每3天半量更換誘導培養基。
全文摘要
本發明公開了一種三維立體培養和誘導骨髓間充質幹細胞成軟骨細胞的方法，包括如下步驟1.將骨髓間充質幹細胞在預置有培養基和微載體的懸浮培養裝置中懸浮培養，在攪拌下擴增骨髓間充質幹細胞；2.然後將成軟骨細胞誘導培養基加入含收穫的Cytodex 3.微載體以及在其上生長的骨髓間充質幹細胞的培養裝置中，對骨髓間充質幹細胞進行聚團成軟骨細胞誘導。本發明的方法可在短時間內一次獲得大量的軟骨細胞，降低了汙染機率，減少了細胞損傷，有利於細胞間營養物質的傳遞。誘導完成後可直接將該複合物移植入體內進行軟骨缺損修復實驗或為科學研究提供充足的種子細胞來源。
文檔編號C12N11/02GK1563364SQ200410017588
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月9日 優先權日2004年4月9日
發明者周燕, 譚文松, 蔣丹丹, 胡靜波 申請人:華東理工大學