一種新的胃癌標誌物及其檢測方法和應用的製作方法

2023-07-18 00:40:11 1

專利名稱：一種新的胃癌標誌物及其檢測方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於胃癌檢測技術領域，涉及一種胃癌血清多肽標誌物及其檢測方法和應用。
背景技術：
目前全球每年新增胃癌患者93.4萬，其中有近40萬在中國內地。患病率和死亡率均超過世界平均水平的兩倍。胃癌的發病率隨年齡的增加而顯著升高，發病的高峰年齡在50歲 80歲。近5年研究發現，中青年人的胃癌發病率迅速增加，19歲至35歲青年人胃癌發病率比30年前翻了一番。胃癌的主要治療方法有早期切除、二期切除、局部消融、介入治療及化療、生物治療、中藥等綜合治療。絕大多數患者在確診時已屬晚期。術後易復發轉移，放化療效果也不理想，預後多不佳。因此，急需探索新的早期診斷和早期治療的手段。血清診斷被認為是早期診斷癌症最新、最有效的方法。它是通過尋找血液中的腫瘤標誌物特別是其中的蛋白標誌來評判腫瘤的發生和發展情況，從而實現對腫瘤早期診斷。人類血清中存在大量蛋白和多肽，其中部分蛋白和多肽的存在和缺失以及表達的高低與人類健康程度密切相關，成為疾病診斷的生物標誌物。而目前比較公認的腫瘤標記物有CEA、CA19-9、CA125、AFP、PSA等，但其對胃癌的篩查缺乏敏感性和特異性，因此並不能用於胃癌的診斷。

發明內容
本發明解決的問題在於提供一種胃癌血清多肽標誌物及其檢測方法和應用，該分子多肽為線粒體烯醇化酶超家族成員I (ENOSFl)的一個片段，是新的胃癌血清標誌物。本發明是通過以下技術方案來實現:一種胃癌血清多肽分子，其胺基酸序列如SEQ.1D.N0.1所示。所述的胃癌血清多肽標誌物，其血清當中的檢測參數為0.67 0.78ng/mL。所述的胃癌血清多肽標誌物作為胃癌血清診斷藥物的靶點的應用。與所述的胃癌血清多肽標誌物相結合的分子在胃癌血清診斷藥物的製備的應用。ENOSFl蛋白作為胃癌血清診斷藥物的靶點的應用。與ENOSFl蛋白相結合的分子在胃癌血清診斷藥物的製備的應用。所述胃癌血清診斷藥物為ELISA檢測胃癌血清多肽標誌物的藥物。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果:本發明公開了一種胃癌血清多肽分子，其胺基酸序列如SEQ.1D.N0.1所不，該分子稱為EN0SF1-A。ENOSFl-A為線粒體烯醇化酶超家族成員I (EN0SF1)的一個片段，其精確分子量為533 4.7道爾頓。ENOSFl-A在胃癌患者血清檢測中呈現特異性的高表達:而在正常對照人群中血清中表達範圍為:0.41 0.54ng/mL ;在胃潰瘍病人血清中表達範圍為:0.45 0.54ng/mL ;在胃癌患者血清中表達範圍為:0.67 0.78ng/mL，且不同組間的表達具有極顯著差異(P〈0.001)。
鑑於ENOSFl-A在胃癌血清中特異性高表達，那麼EN0SF1-A就可以作為胃癌血清診斷標誌物；且其母本蛋白ENOSFl在胃癌患者血清中呈現特異性的高表達，因此，ENOSFl可應用於胃癌患者血清診斷:用基質輔助雷射解析電離飛行時間質譜儀(MALD1-T0F-MS)檢測ENOSFl-A或ELISA方法測檢測ENOSFl的表達水平，可作為胃癌患者檢測的方法。而針對ELISA檢測胃癌血清診斷，ENOSFl就可以作為ELISA檢測藥物的新的靶點。


圖1為同一胃癌患者血清樣本的三次重複的蛋白多肽圖譜(IKDa IOKDa)；圖2為蛋白多肽峰m/z:5335在胃癌患者和正常對照組中的蛋白多肽表達差異；圖3為胃癌患者血清蛋白多肽混合物的凝膠色譜分離圖；圖4為ENOSFl-A的MS/MS質譜鑑定圖譜；圖5為不同組別中ENOSFl蛋白的表達水平。
具體實施例方式本發明提供的·胃癌血清多肽分子，是一種新篩選的胃癌血清診斷標誌物，其表達具有特異性，可應用於胃癌診斷。下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。具體的該胃癌血清診斷標誌物的篩選為:首先應用液體蛋白晶片技術分離提取胃癌患者和正常對照人群血清蛋白多肽，應用基質輔助雷射解析電離飛行時間質譜技術捕獲胃癌患者和正常對照人群蛋白多肽圖譜，並且採用ClinPr0T00ls2.1軟體對比分析胃癌患者和正常人群血清蛋白多肽譜圖差異，找出組間顯著差異表達的蛋白多肽分值，在胃癌患者血清中顯著高表達的蛋白多肽峰值中篩出胃癌血清腫瘤標誌物。對於所篩選的胃癌血清診斷標誌物的驗證為:應用HPLC將胃癌患者血清分離的蛋白多肽混合物分為20 30個組分，在對其進行二級質譜的鑑定，並且對鑑定出的蛋白多肽採用酶聯免疫法進行血清回歸分析，結果血清回歸驗證證明其在胃癌患者血清中顯著高表達，具有特異性，可以作為胃癌患者血清篩查的生物標誌物。1、樣本的採集與處理:採集自西安交通大學第一附屬醫院腫瘤外科(2008年12月至2009年6月)的64例(男性32例；女性32例；平均年齡59歲)病理確診的胃癌患者和32例正常對照人群(男性16例；女性16例；平均年齡56歲)。樣本考慮年齡、性別、採集時間、儲存條件是否一致、有無基礎疾病等因素。被採集者晨起空腹採血，用真空採血管(黃帽、有隔離膠)採集全血5mL，室溫靜置30min ;室溫離心5min (3000g)，將上層血清分裝成100 μ L/管，立即保存於-80°C，避免反覆凍融。1.2試劑與儀器血清蛋白的提取採用德國布魯克公司的磁珠試劑盒「弱陽離子型」(MB-WCX)，以及光譜純(HPLC級)乙腈、三氟乙酸(德國Merck公司)、α -氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA)(美國Sigma公司)。
磁珠分離器、600/384AnchorChip祀板和AutoFlex III基質輔助雷射解析電離飛行時間質譜(Matrix Assisted Laser Desorption 1nization Time of Flight MassSpectrometry, MALD1-TOF-MS)(德國 Bruker Daltonics 公司)。2、血清蛋白樣本的製備運用弱陽離子(MB-WCX)磁珠捕獲血清蛋白多肽，具體操作步驟如下:①用混勻器完全混勻磁珠懸浮液Imin ；②加10 μ L MB-WCX結合液以及10 μ L MB-WCX磁珠至PCR管，混勻後加5 μ L血清，混勻至少5次,靜置5min ；③將PCR管放入磁柱分離器，使磁珠貼壁lmin，液體清澈後棄上清液；④加100 μ L MB-WCX衝洗液，在磁柱分離器上前後移動10次PCR管，磁珠貼壁後棄上清液，重複步驟③、④兩次；⑤加5 μ L MB-WCX洗脫液洗滌貼壁的磁珠，並反覆吹打10次，磁珠貼壁2min，將上清液移入乾淨的尚心管；⑥加5yL MB-WCX穩定液至離心管並混勻，提取的蛋白多肽可以用於直接MALD1-TOF-MS檢測或者凍存於_20°C冰箱24h之內質譜分析。2.2質譜分析將分離收集得到的蛋白樣本IyL與IOyL的基質α -氰基-4-羥基肉桂酸混勻，取I μ L點在Anchorchip祀板上(德國Bruker公司),每個樣本分別點三個祀點以作三次重複。待室溫乾燥後將靶板放入質譜儀進行飛行時間質譜分析，採用FleXContro12.0軟體進行標準品校正後開始樣本檢測，每個樣本要經過總共300次雷射打靶(5次點靶，每次打靶2X30次)之後生成質譜圖，獲得由不同質核比(m/z)組成的蛋白多肽譜圖。採用ClinProTools2.1軟體結合遺傳算法等生物統計學和生物信息學方法分析兩組血清樣本的蛋白多肽圖譜。進行歸一化平滑處理總離子流圖，消除化學及電物理噪聲；分析組間差異蛋白並計算差異大小，按差異大小由大到小排列，找出組間表達具有顯著差異的蛋白多肽峰值(Ρ〈0.001)。將胃癌患者組和正常對照組血清樣本採用磁珠分離系統處理後，經過MALD1-T0F-MS分析後，對胃癌患者組和正常對照組的每個樣本進行蛋白多肽圖譜繪製，在分子量範圍IOOODa IOOOODa共檢測到81個蛋白多肽峰圖，且每個樣本的三次重複穩定性較高，三個樣本的檢測結果如圖1所示。採用ClinProTools〗.1軟體對質譜捕獲的胃癌患者和正常對照組的血清蛋白多肽圖譜進行分析，將胃癌患者血清多肽譜圖與正常人群進行比較分析，共檢測到13個具有極顯著差異的蛋白多肽峰圖(P〈0.001)，其中13個蛋白多肽峰圖在兩組間具有極顯著差異(P〈0.001)，其中7 個蛋白多肽在胃癌患者中表達顯著下調，其餘6個蛋白多肽在胃癌患者中表達顯著上調，具體如表I所示。
權利要求
1.一種胃癌血清多肽標誌物，其特徵在於，其胺基酸序列如SEQ.1D.N0.1所示。
2.如權利要求1所述的所述的胃癌血清多肽標誌物，其特徵在於，其血清當中的檢測參數為 0.67 0.78ng/mL。
3.權利要求1所述的胃癌血清多肽標誌物作為胃癌血清診斷藥物的靶點的應用。
4.與權利要求1所述的胃癌血清多肽標誌物相結合的分子在胃癌血清診斷藥物的製備中的應用。
5.ENOSFl蛋白作為胃癌血清診斷藥物的靶點的應用。
6.與ENOSFl蛋白相結合的分子在胃癌血清診斷藥物的製備的應用。
7.如權利要求6所述的應用，其特徵在於，所述胃癌血清診斷藥物為ELISA檢測胃癌血清多肽分子的藥物。
全文摘要
本發明公開了一種新的胃癌標誌物及其檢測方法。其胺基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。該分子稱為ENOSF1-A，為線粒體烯醇化酶超家族成員1(ENOSF1)的一個片段，其精確分子量為5334.7道爾頓ENOSF1-A在胃癌患者血清檢測中呈現特異性的高表達，用基質輔助雷射解析電離飛行時間質譜儀(MALDI-TOF-MS)檢測ENOSF1-A或ELISA方法測檢測ENOSF1的表達水平，可作為胃癌血清的檢測方法。
文檔編號C12N9/88GK103224922SQ201310126020
公開日2013年7月31日 申請日期2013年4月11日 優先權日2013年4月11日
發明者楊娟, 黃辰, 宋土生, 倪磊 申請人:西安交通大學