霍亂弧菌的鏈置換擴增恆溫擴增(sda)快速檢測試劑盒及其檢測方法

2023-07-17 15:12:41

專利名稱：霍亂弧菌的鏈置換擴增恆溫擴增(sda)快速檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測領域，具體涉及恆溫擴增快速檢測霍亂弧菌的試劑盒及檢測方法。
背景技術：
霍亂是由霍亂弧菌(Vibrio cholerae)引起的急性腸道傳染病，屬於國際檢疫傳染病之一，也是我國法定管理的甲類傳染病。它可引起流行、爆發和大流行。臨床特徵為劇烈腹瀉、嘔吐、大量米泔樣排洩物、水電解質紊亂和周圍循環衰竭，嚴重休克者可並發急性腎功能衰竭。由於霍亂流行迅速，且在流行期間發病率及死亡率均高，危害極大，因此早期迅速和正確的診斷，對治療和預防本病的蔓延有重大意義。霍亂在我國主要發生在夏秋季節，高峰期在7-8月間。2004年年末印度洋大地震和海嘯中遇難人數突破15萬，重災區最先出現的疫情就有霍亂。霍亂弧菌現有的檢測方法主要有常規分離鑑定法、普通PCR檢測法、螢光定量PCR 檢測法、膠體金免疫層析試驗法等。目前尚未見用鏈置換擴增(SDA)技術快速、準確地檢測上述菌株的試劑盒及其檢測方法的報導。

發明內容
本發明的目的是提供一種霍亂弧菌的恆溫擴增快速檢測試劑盒及其檢測方法。本發明的另一目的是提供一種霍亂弧菌的快速檢測方法，以克服現有技術的不足，從而為食品安全提供科學的依據和指導作用。本發明提供的霍亂弧菌的恆溫擴增快速檢測試劑盒，包括(1)模板預處理反應液包括IXNEB buffer 2，1. 0 μ M上遊內引物Si、1. 0 μ M下遊內引物S2、3% (V/V) 二甲基亞碸、和ddH20。所述IXNEB buffer 2 為5mM NaClUmM Tris-HClUmM MgCl2、0. ImM 二硫蘇糖醇、和 ddH20，pH 7. 9。所述引物Si、S2分別如SEQ ID NO :1和2所示。(2)鏈置換擴增反應液I :3% (V/V) 二甲基亞碸，0. lmg/mL牛血清白蛋白，濃度分別為 0. 2mM 的 dATP、dGTP 和 dTTP，1. OmM dCTP α S，1 XNEB buffer 2，和 ddH20。(3) Bst DNA 聚合酶；(4)限制性內切酶BsoBI。使用上述試劑盒檢測霍亂弧菌的方法，包括步驟(1)待檢樣品或細菌DNA的提取提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA 0D26Q/0D28Q在1.6-2.0範圍內，濃度在 IO-IOOng/μ L 範圍內。(2)模板預處理程序
取模板預處理反應液23 μ L，加入待檢DNA 2 μ L，放入94°C水浴5min後迅速放入 590C的水浴中4 ；然後94°C水浴2 和59°C水浴4 過程反覆進行6個以上循環；產物用作SDA模板。(3) SDA擴增首先將上述預處理的25 μ L模板溶液加入2 μ L鏈置換擴增反應液I中，95°C水浴加熱5min，溫度迅速冷卻到0°C，然後加入0. 4yL Bst DNA Polymerase 與0. 4yL BsoBI，置於59 °C水浴反應Ih。(4)核酸凝膠電泳檢測反應結束後，用瓊脂糖凝膠電泳檢測；電泳板上出現IOObp的核酸擴增條帶，說明待檢樣品為陽性，否則為陰性。本發明的試劑盒根據目標菌株的保守基因序列設計引物，保證檢測方法的特異性。本發明採用改進的鏈置換擴增技術(SDA)技術，特異性強，具有與PCR檢測方法相似靈敏度，但不需要昂貴的PCR儀，只需普通的水浴鍋即可，檢測方法簡單、快速，特別適用於基層醫療機構及食品公司與相關檢測部門。


圖1 其中，1陰性對照2-3霍亂弧菌樣品4霍亂弧菌陽性對照5 DNA Marker
具體實施例方式SDA(Strand displacement amplification)反應是一種恆溫、酶控的體外核酸擴增技術，主要依據限制性內切酶識別並切割半硫代磷酸化DNA的未修飾鏈以形成一個切口，在具有鏈置換能力的DNA聚合酶的作用下從切口處聚合延伸並取代下遊DNA鏈。被置換下的單鏈DNA再與引物結合併由DNA聚合酶延伸成雙鏈DNA。這種「切口一擴增一置換」 不斷循環往復達到靶序列高效擴增的目的。基於上述原理，本發明提供的霍亂弧菌的恆溫擴增快速檢測試劑盒，包括(1)模板預處理反應液包括IXNEB buffer2，1. 0 μ M上遊內引物(Sl)U. 0 μ M下遊內引物(S2)、體積比3% DMSO(二甲基亞碸)、和ddH20。所述IXNEB buffer 2 為5mM NaCUlmM Tris-HCUlmM MgCl2、0. ImM Dithiothreitol ( 二硫蘇糖醇)、和 ddH20, pH 7. 9。霍亂弧菌引物Sl 5' -CAGCCTGACACCAGACAA- CTCGGG-AAGACAAC GCATTACC -3' (SEQ ID NO: 1)S2 5，-ACCGCATCGAATGCATGT- crCGGG-GGCTTGCATGACTATC "3' (SEQ ID NO: 2)(注其中黑體部分為與霍亂弧菌hlyA基因片段匹配的序列) (2)鏈置換擴增反應液I 體積比3. 0 % DMSO, 0. lmg/mL BSA (牛血清白蛋白)，濃度分別為 0. 2mM 的 dATP、dGTP 和 dTTP，1. OmM dCTP α S (購自 BIOLOG 公司(德國)、2，_deo xyeytidine-5' -0-(1-thiotriphosphate) > 100 μ L(IOOmM)), 1 XNEB buffer 2，ddH20o
(3) Bst DNA Polymerase (購自 NewEnglandBiolabsLTD、鏈延伸 DNA 聚合酶、 8000U/mL)
(4) BsoBI (購自 NewEnglandBiolabsLTD、限制性內切酶 BsoBI、10000U/mL)使用上述試劑盒檢測霍亂弧菌的方法，包括步驟(1)待檢樣品或細菌DNA的提取提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA OD260/OD280在1. 6-2. O範圍內，濃度在 IO-IOOng/μ L 範圍內。(2)模板預處理程序取模板預處理反應液23 μ L，加入待檢DNA 2 μ L，放入94°C水浴5min後迅速放入 590C的水浴中4 ；然後94°C水浴2 和59°C水浴4 過程反覆進行6個以上循環；產物用作SDA模板。(3) SDA擴增首先將上述預處理的25 μ L模板溶液加入24. 2 μ L鏈置換擴增反應液I中，95°C水浴加熱5min，溫度迅速冷卻到0°C，然後加入0. 4yL Bst DNA Polymerase 與0. 4 μ LBsoBI，置於59°C水浴反應Ih。(4)核酸凝膠電泳檢測反應結束後，在反應管中加入6XLoading buffer (組分30mM EDTA ；36% (ν/ν) Glycerol ；0. 05% (w/v)Xylene Cyanol FF ；0. 05% (w/v)Bromophenol Blue),自然冷卻至室溫，用瓊脂糖凝膠電泳檢測產物，電泳40分鐘，電泳成像系統拍照。電泳板上出現IOObp的核酸擴增條帶，說明待檢樣品為陽性，否則為陰性。下列實施例進一步說明本發明，但不應當作為本發明的限制。實施例(霍亂弧菌的檢測)(1)待檢樣品或細菌DNA的提取提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA OD260/OD280在1. 6-2. O範圍內，濃度在 IO-IOOng/μ L 範圍內。(2)模板預處理程序取模板預處理反應液23 μ L，加入待檢DNA 2 μ L，放入94°C水浴5min後迅速放入 590C的水浴中4 ；然後94°C水浴2 和59°C水浴4 過程反覆進行6個以上循環；產物用作SDA模板。取2份模板預處理反應液23 μ L，分別加入2 μ L ddH20和霍亂弧菌DNA，重複上述步驟，產物用作SDA模板，作為陰性對照和陽性對照；(3) SDA擴增首先將上述預處理的25 μ L模板溶液加入24. 2 μ L鏈置換擴增反應液I中，95°C水浴加熱5min，溫度迅速冷卻到0°C，然後加入0. 4yL Bst DNA Polymerase 與0. 4yL BsoBI，置於59 °C水浴反應Ih。(4)核酸凝膠電泳檢測反應結束後，在反應管中加入6XL0ading buffer，自然冷卻至室溫，用瓊脂糖凝膠電泳檢測產物，電泳40分鐘，電泳成像系統拍照。結果如圖1所示。說明此檢測方法特異性強，快速可靠，具有簡單快速的特點。
權利要求
1.一種霍亂弧菌的恆溫擴增快速檢測試劑盒，其特徵在於包括(1)模板預處理反應液1XNEBbuffer 2，1. 0 μ M上遊內引物Sl、l. 0 μ M下遊內引物 S2,3% (V/V) 二甲基亞碸、和 ddH20 ；所述 IXNEB buffer 2 為5mM NaClUmM Tris-HClUmM MgCl2、0. ImM 二硫蘇糖醇、和 ddH20, pH 7. 9 ；所述引物Si、S2分別如SEQ ID NO :1和2所示；(2)鏈置換擴增反應液I:3% (V/V) 二甲基亞碸，0. lmg/mL牛血清白蛋白，濃度分別為 0. 2mM 的 dATP、dGTP 和 dTTP，1. OmM dCTP α S，1 XNEB buffer 2，和 ddH20 ；(3)Bst DNA 聚合酶；(4)限制性內切酶BsoBI。
2.使用權利要求1所述試劑盒檢測霍亂弧菌的方法，其特徵在於包括步驟(1)待檢樣品或細菌DNA的提取提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA OD26tZOD28tl在1. 6-2. 0範圍內，濃度在 IO-IOOng/μ L 範圍內；(2)模板預處理程序取模板預處理反應液23 μ L，加入待檢DNA 2 μ L，放入94°C水浴5min後迅速放入59°C 的水浴中4 ；然後94°C水浴2 和59°C水浴4 過程反覆進行6個以上循環；產物用作 SDA模板；(3)SDA擴增首先將上述預處理的25 μ L模板溶液加入2 μ L鏈置換擴增反應液I 中，95°C水浴加熱5min，溫度迅速冷卻到0°C，然後加入0.4yL Bst DNA聚合酶與0. 4 μ L BsoBI，置於59°C水浴反應Ih ；(4)核酸凝膠電泳檢測反應結束後，用瓊脂糖凝膠電泳檢測；電泳板上出現IOObp的核酸擴增條帶，說明待檢樣品為陽性，否則為陰性。
全文摘要
本發明涉及一種霍亂弧菌恆溫擴增快速檢測試劑盒及其檢測方法。該試劑盒內有模板預處理反應液、鏈置換擴增反應液Ⅰ、Bst DNA Polymerase，BsoBI。方法包括細菌DNA的提取、模板預處理、SDA鏈置換恆溫擴增、核酸檢測。其優點是快速、特異性強、靈敏度高而且成本低。
文檔編號C12Q1/68GK102382886SQ201110345120
公開日2012年3月21日 申請日期2011年11月4日 優先權日2011年11月4日
發明者喬寧, 周斌, 唐學璽, 宋濤, 尼秀媚, 李美芹, 段方猛, 王悠, 白樺, 雷質文 申請人:中國海洋大學