一種高粱紅曲菌M‑3原生質體製備方法與流程
2023-07-08 05:36:16 1
本發明涉及高粱紅曲菌M-3原生質體製備方法。
背景技術：
紅曲菌是一種典型的紅麴黴屬絲狀真菌，早在我國的古籍中就有記載。紅曲菌能夠在發酵培養的過程中產生多種次級代謝產物， 有一定的保健活性，具有降血壓、降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗糖尿病及抗癌等作用。但已有研究發現，一些紅曲菌菌株在發酵培養的過程中會產生桔黴素，對人畜均有一定的毒害作用，這種真菌毒素的產生很難通過改變發酵條件或者菌株篩選等來抑制。
福建農林大學前期從福建傳統紅曲中分離篩選到1株高產紅曲色素的紅麴黴菌株，經形態學、生理生化以及分子生物學研究被鑑定為高粱紅曲菌。然而，這株高粱紅曲菌菌株同樣也高產桔黴素，通過發酵培養基和發酵工藝條件的優化至今仍無法將其桔黴素的產量降低到安全水平，從而限制了這株功能性紅曲菌的應用。若能利用現代生物學技術和先進的分析方法，如通過細胞融合技術構建一種能夠高產色素，不產桔黴素或低產桔黴素的紅麴黴菌株，解決紅曲菌在發酵的過程中高產桔黴素的問題，將有利於拓展功能性紅曲的應用範圍。
原生質體是絲狀真菌進行細胞的融合以及遺傳轉化的重要工具，是分子遺傳研究的基礎，國內外很多學者都是在原生質體基礎上進行遺傳轉化，關於原生質體的製備與再生已有大量相關文獻報導，但未涉及高粱紅曲菌原生質體製備以及再生方法的研究。目前，原生質體的製備已有的研究絕大部分是利用複合裂解酶去除細胞壁，但是由於不同種類的微生物，其細胞壁組成各有差異，從而導致其原生質體製備的條件也各不相同。在原生質體製備的過程中，滲透壓穩定劑的作用是維持原生質體膜系統滲透壓的平衡，有效防止原生質體破裂、失活，因此滲透壓穩定劑對原生質體的形成和再生都有重要的作用。其次，酶解是原生質體製備與再生過程中的關鍵環節，在細胞壁降解的過程中，生成的原生質體被釋放到在含各種裂解酶的滲透壓穩定劑中，其膜質系統容易受到破壞，導致原生質體難以再生、甚至失活，因此酶解條件（時間、ｐH 值、溫度等） 對得到理想的原生質體具有重要的意義。
技術實現要素：
本發明提出一種高粱紅曲菌M-3原生質體製備方法。
一種高粱紅曲菌M-3原生質體製備方法，其特徵在於包括以下步驟：
（1）取纖維素酶、蝸牛酶、山梨醇、檸檬酸、磷酸氫二鈉、高滲透穩定液、山梨醇、酶解液備用，以上原料均為市售；
（2）取高粱紅曲菌M-3在搖床上以200轉/分鐘的速度，培養，溫度為30℃，培養時間為60小時；
（3）收集菌絲體，置於50毫升的無菌離心管中，以高滲透穩定液洗滌，並於4000轉/分鐘的速度，在4℃離心10分鐘獲得沉澱物，按質量體積比為1∶30的人比例加入裂解酶液，在30℃，以120轉/分鐘的振蕩酶解3小時，然後離心取沉澱；
（4）用高滲透穩定液洗滌2次除去酶液，用血球計數板計數，最後再次離心，得到沉澱物即原生質體。
優選地，高滲透穩定液為1摩爾/升山梨醇。
優選地，所述酶解液為在PH8.0的50mmol/Lde trips緩衝液中各加入0.3％的纖維素酶和0.3％的蝸牛酶,在4℃低溫保藏。
優選地，所述緩衝液的配製為rHYL4的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液與C6H8O·7H2O混合。
本發明所述高粱紅曲菌M-3原生質體製備方法，原生質體形成數為3000000個/毫升，原生質體原生質體再生率19.33％，再生菌落數為5800000個/毫升。
具體實施方式
實施例1。
一種高粱紅曲菌M-3原生質體製備方法，其特徵在於包括以下步驟：
（1）取纖維素酶、蝸牛酶、山梨醇、檸檬酸、磷酸氫二鈉、高滲透穩定液、山梨醇、酶解液備用，以上原料均為市售；
（2）取高粱紅曲菌M-3在搖床上以200轉/分鐘的速度，培養，溫度為30℃，培養時間為60小時；
（3）收集菌絲體，置於50毫升的無菌離心管中，以高滲透穩定液洗滌，並於4000轉/分鐘的速度，在4℃離心10分鐘獲得沉澱物，按質量體積比為1∶30的人比例加入裂解酶液，在30℃，以120轉/分鐘的振蕩酶解3小時，然後離心取沉澱；
（4）用高滲透穩定液洗滌2次除去酶液，用血球計數板計數，最後再次離心，得到沉澱物即原生質體。
實施例2。
一種高粱紅曲菌M-3原生質體製備方法，其特徵在於包括以下步驟：
（1）取纖維素酶、蝸牛酶、山梨醇、檸檬酸、磷酸氫二鈉、高滲透穩定液、山梨醇、酶解液備用，以上原料均為市售；
（2）取高粱紅曲菌M-3在搖床上以200轉/分鐘的速度，培養，溫度為30℃，培養時間為60小時；
（3）收集菌絲體，置於50毫升的無菌離心管中，以高滲透穩定液洗滌，並於4000轉/分鐘的速度，在4℃離心10分鐘獲得沉澱物，按質量體積比為1∶30的人比例加入裂解酶液，在30℃，以120轉/分鐘的振蕩酶解3小時，然後離心取沉澱；
（4）用高滲透穩定液洗滌2次除去酶液，用血球計數板計數，最後再次離心，得到沉澱物即原生質體。
（5）所述高滲透穩定液為1摩爾/升山梨醇。
實施例3。
一種高粱紅曲菌M-3原生質體製備方法，其特徵在於包括以下步驟：
（1）取纖維素酶、蝸牛酶、山梨醇、檸檬酸、磷酸氫二鈉、高滲透穩定液、山梨醇、酶解液備用，以上原料均為市售；
（2）取高粱紅曲菌M-3在搖床上以200轉/分鐘的速度，培養，溫度為30℃，培養時間為60小時；
（3）收集菌絲體，置於50毫升的無菌離心管中，以高滲透穩定液洗滌，並於4000轉/分鐘的速度，在4℃離心10分鐘獲得沉澱物，按質量體積比為1∶30的人比例加入裂解酶液，在30℃，以120轉/分鐘的振蕩酶解3小時，然後離心取沉澱；
（4）用高滲透穩定液洗滌2次除去酶液，用血球計數板計數，最後再次離心，得到沉澱物即原生質體。
（5）所述高滲透穩定液為1摩爾/升山梨醇；所述酶解液為在PH8.0的50mmol/Lde trips緩衝液中各加入0.3％的纖維素酶和0.3％的蝸牛酶,在4℃低溫保藏；所述緩衝液的配製為rHYL4的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液與C6H8O·7H2O混合。