產l－精氨酸的大腸桿菌及生產l－精氨酸的方法
2023-08-10 12:51:06
專利名稱：產l－精氨酸的大腸桿菌及生產l－精氨酸的方法
技術領域：
本發明涉及生產L-精氨酸的大腸桿菌和通過用大腸桿菌發酵生產L-精氨酸的方法。L-精氨酸是工業上有用的胺基酸，可以用作肝功能促進劑，胺基酸輸注用品和各種胺基酸製品的成分。
已知一些抗精氨酸的類似物和吡啶的大腸桿菌的突變體可以生產精氨酸(Pierard A.and Glansdorf N.，Mol.Gen.Genet.，118，235，1972.and Glansdorf N.，Biosynthesis of arginine andpolyamines.In″E.Coli and Salm.thyphimurium，1996)。另外，還有一些使用抗其它藥物的大腸桿菌突變體或重組大腸桿菌的菌株的方法，其中在重組的大腸桿菌中導入了一種編碼精氨酸生物合成途徑酶的基因。
在大腸桿菌K12的精氨酸的生物合成途徑中，每消耗1摩爾的乙醯輔酶A，將釋放1摩爾的乙酸和產生1摩爾的精氨酸(
圖1)。由於有乙酸副產品產生，相當部分的碳源被消耗了；此外，乙酸的積聚還惡化了精氨酸生產株培養物的生長。
還已知大腸桿菌不能有效的利用乙酸作為碳源。
根據以上的觀點，本發明人設想如果生產精氨酸的菌株能夠再利用乙酸的話，則精氨酸的產量可以會更高。因此，本發明的一個目的是提供能夠利用乙酸的精氨酸生產菌株和利用該菌株生產精氨酸的方法。
於是本發明人就構建了能夠利用乙酸並能夠提高精氨酸的產率的大腸桿菌精氨酸生產者突變株。從而完成了本發明。
也就是說，本發明提供了能夠生產精氨酸並能利用乙酸的大腸桿菌。
本發明還提供了生產精氨酸的方法，包括包括在培養基中培養能夠利用乙酸和能夠產生精氨酸的大腸桿菌以產生和積聚精氨酸的步驟，和從培養基中收集精氨酸的步驟。
在本發明中，胺基酸是L-構型的。
本發明將詳述如下。
本發明的大腸桿菌能夠利用乙酸並能夠產生精氨酸。可以通過將利用乙酸的能力導入到能夠產生精氨酸的大腸桿菌菌株或者通過將產生精氨酸的能力導入到具有利用乙酸能力的大腸桿菌菌株中從而得到同時能利用乙酸和產生精氨酸的菌株中。
對本發明來說，術語「能夠產生精氨酸」指當本發明的大腸桿菌菌株培養在培養基中時能夠在培養基中產生和積聚精氨酸。術語「能夠利用乙酸」指相對於親本菌株來說可以更有效的代謝乙酸或乙酸鹽，例如，當該大腸桿菌菌株培養在含乙酸或乙酸鹽作為唯一碳源的培養基中時，本發明所用的大腸桿菌菌株生長得比親本菌株快。更具體的，可以這樣說，如果該菌株在含乙酸或乙酸鹽作為唯一碳源的培養基上培養時，其生長比親本菌株快，就可以說該菌株可以利用乙酸；例如，在合適的條件下培養在含5g/l乙酸銨的液體基本培養基A中(如下文所述)。更具體的，當在合適的條件下，將該菌株培養在含乙酸或乙酸鹽作為唯一碳源的培養基，例如，含有5g/l的乙酸銨的瓊脂培養基上時，如果該菌株37℃，2天時形成了細菌菌落，就可以說該大腸桿菌菌株能夠利用乙酸。術語「合適的條件」指溫度，pH，空氣供應或任選的對待培養的大腸桿菌菌株必需的營養。
作為獲得本發明的大腸桿菌菌株的方法的一個例子，下面將介紹一個通過從一個能夠產生精氨酸的大腸桿菌菌株誘導產生一個能夠利用乙酸的突變體。
能夠產生精氨酸的大腸桿菌的例子沒用特別的限定，只要這樣的大腸桿菌菌株能夠被賦予利用乙酸的能力即可。這樣的大腸桿菌的例子包括從大腸桿菌K-12，B，C或其衍生物培養得到精氨酸生產菌株。作為大腸桿菌精氨酸生產者的例子，可以列舉如下抗α-甲基甲硫氨酸，p-氟苯基丙氨酸，D-精氨酸，精氨酸氧肟酸鹽，s-(2-氨乙基)-半胱氨酸，α-甲基絲氨酸，β-2-噻吩基丙氨酸或磺胺胍的突變體(日本專利申請公開56-106598)，導入了編碼N-乙醯穀氨酸合成酶的argA基因的精氨酸生產株等(日本專利申請公開57-5693)。下文實施例中所描述的大腸桿菌菌株237也是一個優選的精氨酸生產菌株。菌株237已經被保藏在俄羅斯國立工業微生物保藏中心(VKPM)，保藏號VKPM B-7925，保藏日期2000年4月19日，並且在2001年5月18日根據布達佩斯條約轉移到國際保藏。
如上所述，可以從精氨酸生產株獲得能利用乙酸的突變株，例如，對精氨酸生產株進行突變處理並篩選能在含乙酸或乙酸鹽作為唯一碳源的培養基上生長的菌株。可以通過例如，紫外照射或用人工致突變劑如1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍(NTG)和亞硝酸進行突變處理。對能夠利用乙酸的突變株致突和篩選可以重複2次以上。
可以通過在培養基中培養上述的能利用乙酸和能產生精氨酸的大腸桿菌而在培養基中產生和積累精氨酸並從培養基中收集精氨酸。
在棒狀桿菌中，由穀氨酸乙醯化為N-乙醯穀氨酸和N-乙醯穀氨酸脫乙醯化為鳥氨酸的反應是由同一個酶催化的，即鳥氨酸乙醯轉移酶。另一方面，在大腸桿菌的生物合成途徑中，乙醯化和脫乙醯化是不同的酶催化的，分別是N-乙醯穀氨酸合成酶和N-乙醯鳥氨酸酶。因此，如果可以利用副產品乙酸的話，其精氨酸的生產能力是未知的。
在本發明的生產精氨酸的方法中，可以使用與大腸桿菌發酵生產精氨酸類似的方式培養大腸桿菌，以及在液體培養基中收集和純化精氨酸。
作為碳酸，可以使用糖類如葡萄糖，乳糖，半乳糖，果糖，或澱粉水解產物；醇類可以使用甘油或山梨糖醇；或有機酸如乙酸，富馬酸，檸檬酸或琥珀酸。
作為氮源，可以使用無機銨鹽，如硫酸銨，氯化銨，或磷酸銨；有機氮如大豆水解物；氨氣或氨水。
還需要含有適量的物質如維生素B1和L-異亮氨酸或酵母提取物作為有機痕量營養物。除此之外，如果需要，還可以加入少量的磷酸鉀，硫酸鎂，鐵離子，錳離子等。
培養優選在通氣條件下進行16-72小時。培養溫度控制在25-45℃，pH值控制在5-8。可以使用無機或有機酸，鹼以及氨氣等調節pH值。
可以結合離子交換樹脂和其他已知的方法從發酵液中收集精氨酸。
實施發明的最佳方式下面將參照實施利隊本發明進行具體的描述。實施例1可以利用乙酸的突變體的誘導從產精氨酸的突變體大腸桿菌菌株237，可以誘導出在含有乙酸銨(5g/l作為唯一碳源和氮源的M9瓊脂培養基上生長良好的突變株。菌株237是一個抗吡啶類似物6-氮尿吡啶的突變體，它是用1-甲基-3-硝基-亞硝基胍從大腸桿菌K12ilvA∷Tn5誘導而來的。菌株237在含乙酸銨作為唯一碳源和氮源的M9瓊脂培養基上生長很差。改菌株已經於2000年4月10日保藏在俄羅斯國立工業微生物保藏中心(VKPM)，保藏號是VKPM B-7925，並已經在2001年5月18日根據布達佩斯條約轉移為國際保藏。
菌株237的細胞在L-肉湯中振蕩(試管，37℃)培養過夜並離心收集之。然後將細胞重新懸浮於含有0.1mg/ml NTG的鹽溶液中(0.8％)。在37℃與NTG接觸30分鐘後，離心得到細胞，用鹽水洗滌2次並在基本培養基A上鋪板，其中基本培養基A每1升水(pH7.0)中含有5g乙酸銨，6g磷酸氫二鉀，3g磷酸二氫鉀，0.5gNaCl，0.1mg硫胺素，0.1gL-異亮氨酸，15g瓊脂。
37℃，培養平板5天。收集2天內在平板上出現的菌落並用相同的瓊脂平板劃線純化之。親本菌株237隻有在培養5天後才形成菌落。可利用乙酸的突變體的出現頻率為6*10-5。測試了70個純化菌株的精氨酸產力。約1/4的突變株比親本菌株237產力高。其中，最好的產精氨酸的菌株是382。已經將菌株382於2000年4月10日保藏在俄羅斯國立工業微生物保藏中心，保藏號是VKPM B-7926，並於2001年5月18日根據布達佩斯條約轉移為國際保藏。實施例2新突變體在乙酸鹽上的生長將2ml含乙酸銨(5g/l)或葡萄糖(5g/l)作為唯一碳源的液體基本培養基A(未加瓊脂)放入試管中，接種一環新菌株382，另一個精氨酸生產菌株383和親本菌株237，32℃振蕩培養16小時。通過其在540nm的光密度確定培養物的生長。在培養開始時，培養基的光密度為大約0.05。結果如下表1。
表1
實施例3用新的L-精氨酸生產突變株通過試管發酵生產精氨酸將新菌株382，383及其親本菌株237培養在發酵培養基中。發酵培養基每1升自來水(pH7.2)含有60g葡萄糖，25g硫酸銨，2gKH2PO4，1gMgSO4.7H2O，0.1mg硫胺素，5g酵母提取物(Difco)，25g硫酸鈣。將葡萄糖和白堊分別滅菌。將2ml培養基加入到試管中，接種一環待試微生物，32℃振蕩培養3天。培養基中積累的精氨酸的量如下表2所示。
表2
實施例4用新的產精氨酸的突變體通過發酵罐生產精氨酸新的菌株382及其親本菌株237在L-肉湯中32℃振蕩培養8小時。然後，將得到的60ml種子培養物接種到1升的發酵罐中，其中發酵罐中含有0.5L發酵培養基，然後在32℃，700rpm攪拌培養，通氣率為0.51/min。發酵培養基在1L自來水(pH7.0)中含有100g葡萄糖，9g硫酸銨，1gKH2PO4，0.4gMgSO4.7H2O，0.02gFeSO4，0.02gMnSO4.7H2O，0.2g大豆水解產物總氮，0.3gL-異亮氨酸，0.4g硫胺素。在培養中，加入銨溶液(4.7M)以調節pH為7.0並提供氮源。培養42小時。培養基中積累的精氨酸的量和以葡萄糖為碳源的培養基中的精氨酸的產率如表3所示。
表3
與親本菌株相比，可以利用乙酸的突變株的精氨酸的產率更高。
權利要求
1.能夠產生精氨酸並能夠利用乙酸的大腸桿菌。
2.權利要求1的大腸桿菌，其中當該細菌培養在含有乙酸或乙酸鹽作為唯一的碳源的瓊脂培養基上時，可以在37℃，2天形成菌落。
3.權利要求1或2的大腸桿菌，其中該細菌來源於大腸桿菌K12。
4.一種生產精氨酸的方法，包括在培養基中培養權利要求1-3任一項大腸桿菌以產生和積聚精氨酸的步驟，和從培養基中收集精氨酸的步驟。
全文摘要
可以通過在培養基中培養大腸桿菌並從培養基中收集精氨酸而有效的生產精氨酸,其中該大腸桿菌能夠產生精氨酸並能夠利用乙酸從而可在培養基中產生和積聚精氨酸。
文檔編號C12N1/20GK1332250SQ0112188
公開日2002年1月23日 申請日期2001年6月28日 優先權日2000年7月6日
發明者M·M·古斯雅蒂納, T·V·萊奧諾瓦, L·R·普蒂特斯恩, T·A·雅普斯卡亞 申請人:味之素株式會社