一種β-1，6-N-乙醯葡萄糖苷酶NagY1的製備方法
2023-07-09 01:27:36 2
專利名稱：一種β-1，6-N-乙醯葡萄糖苷酶NagY1的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種降解β-1，6-Ν-乙醯葡聚糖胺的多糖水解酶的製備方法。具體地，本發明涉及一種從海洋微生物中篩選的N-乙醯葡萄糖苷酶NagYl，以及該酶的製備方法。
背景技術：
近幾年來，人們發現自然界和宿主體的細菌絕大多數以生物膜(biofilm)形式存在，而不是簡單地以單細胞的浮遊形式存在。生物膜是由細菌和其分泌的胞外基質在物體表面形成的高度組織化的多細胞結構。一旦形成生物膜，細菌將具有極強的抗生素耐藥性 (比浮遊細菌高100-1000倍)和逃避機體免疫系統攻擊的能力。然而，當細菌從生物膜中釋放出來，重新以浮遊方式生長時，又恢復對抗生素敏感。生物膜無處不在，在很多方面給人類生活帶來嚴重的影響，已成為全球關注的重大科學難題。根據美國NIH的調查公告， 80%以上的細菌性感染與生物膜有關。胞外多糖是細菌生物膜的主要成分，它決定了生物膜的結構和功能。最新研究表明，β-1，6-N-乙醯氨基葡聚糖是多種人類、動物、植物的病原菌生物膜的主要成分，如臨床上常見的金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌、伴放線放線桿菌等。因此，本發明的目的是提供一種降解β_1，6-Ν-乙醯葡聚糖胺的多糖水解酶的製備方法。
發明內容
本發明的目的之一是提供一種正確合適的發酵方法發酵產酶菌株並得到粗酶液。本發明的另一目的是提供一種分離純化方法得到N-乙醯葡萄糖苷酶NagYl的純酶。根據本發明的一個技術方案，從海洋微生物中篩選得到一種新的產N-乙醯葡萄糖苷酶NagYl的菌株QY403，通過正確合適的發酵方法發酵產酶菌株並得到粗酶液。根據本發明的另一技術方案，本發明提供了一種分離純化得到的N-乙醯葡萄糖苷酶NagYl，該酶的分子量為40. 2kD。
具體實施例方式實施例1菌株的發酵條件發酵培養基每升含β -1，6-Ν-乙醯葡聚糖胺3g、KH2P043g、K2HPO4 · 3H207g、 (NH4)2S042g、NaCl 30g、MgSO4 · 7H20 llg、FeSO4 · 7H20 llg, pH 6. 0，IOOkP 滅菌 15min。固體培養基中添加1. 5%瓊脂。搖動容器直至溶質溶解，用5mol/LNa0H(約0. 2mL)調節pH值至7.0，加入去離子水至總體積為1升，於1.034X 105 高壓下蒸汽滅菌20min。將種子按的比例接入發酵培養基，於25°C 150r/min培養3d。4°C 12000r/min 離心IOmin去除菌體，上清液即為粗酶液。實施例2N-乙醯葡萄糖苷酶NagYl的分離純化與性質分析
(1)硫酸銨沉澱粗分離發酵液上清中緩慢加入硫酸銨至80%飽和度，4°C靜置3h ；40°C 12000r/min離心 30min,棄去上清液，沉澱溶於20mmol/LpH7. 5磷酸鹽緩衝液，對同樣的緩衝液4°C透析過夜；40°C 13000r/min離心30min取上清液，即為粗酶液。(2)離子交換層析粗酶液上樣於以20mmol/L pH7. 5磷酸鹽緩衝液平衡的DEAES印harose FastFlow 柱進行離子交換層析。層析所用緩衝液體系為磷酸鹽緩衝液，A液為20mmol/L pH7. 5磷酸鹽緩衝液，B液為含有2. Omol/L NaCl的A液。層析柱體積為Hml (IcmX 20cm)，上樣量為 :3ml，採取NaCl濃度梯度洗脫，流速1. Oml/min,以紫外吸收法檢測收集物的N-乙醯氨基葡萄糖苷酶NagYl活性，大量收集活性組分。(3)凝膠過濾層析離子交換收集到的活性組分進行凝膠過濾層析，Superdex75HR 10/30柱用 20mmol/L pH7. 5磷酸鹽緩衝液平衡，上樣量1. Oml,以平衡液洗脫，流速0. 5ml/min，檢測收集物活性，大量收集高活性組分，濃縮備用。以上層析純化操作均在4°C進行。經過硫酸銨沉澱、離子交換層析以及凝膠過濾層析收集的酶液，進行SDS-PAGE電泳。電泳結果表明純化後的樣品只有一條帶，達到電泳純水平。根據分子量標準進行計算， N-乙醯氨基葡萄糖苷酶NagYl分子量大約為40. 2kD。
權利要求
1.一種N-乙醯葡萄糖苷酶NagYl的產酶菌株的發酵方法。
2.—種N-乙醯葡萄糖苷酶NagYl的分離純化方法。
全文摘要
本發明涉及一種N-乙醯葡萄糖苷酶NagY1的製備方法。具體地，本發明涉及一種從海洋微生物中篩選的N-乙醯葡萄糖苷酶NagY1，通過正確合適的發酵方法發酵產酶菌株並得到粗酶液，利用硫酸鉸沉澱、離子交換層析和凝膠過濾層析技術，從發酵液上清中分離純化到該酶。
文檔編號C12N9/24GK102399762SQ20101028533
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月19日 優先權日2010年9月19日
發明者於文功, 劉忠, 張貴民, 譚玉龍, 趙志全, 韓峰 申請人:中國海洋大學, 魯南製藥集團股份有限公司